基于DNA甲基化/羥甲基化水平中藥調控冠心病血瘀證相關基因分子生物學研究進展

張書萌，陳伶利，張湘卓，曾雪芹，張夢雪，李仙福，江雨潔，李杰

基于DNA甲基化/羥甲基化水平中藥調控冠心病血瘀證相關基因分子生物學研究進展

張書萌，陳伶利，張湘卓，曾雪芹，張夢雪，李仙福，江雨潔，李杰

湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

冠心病是多基因遺傳和環境等因素相互作用的復雜性疾病，血瘀證是其常見證型之一。目前，表觀遺傳學是心血管領域研究的熱點，通過表觀遺傳學機制可解釋基因和環境的交互作用，冠心病的發生發展與DNA異常甲基化關系密切，而表觀遺傳學的修飾可逆。本文以DNA甲基化作為冠心病血瘀證新的診療工具，論述通過中藥干預手段調控冠心病血瘀證相關基因羥甲基化修飾的研究進展，亦為中醫證候本質研究提供新思路。

冠心病；血瘀證；中藥干預；DNA甲基化；DNA羥甲基化；綜述

冠心病（coronary heart disease，CHD）是指冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導致心肌缺血缺氧而引起的心臟病。據心血管病流行病學調查顯示，心血管病死亡率占全球總死亡率的30%，又以缺血性心臟病死亡率上升最為顯著[1-2]。作為多基因遺傳和環境等因素相互作用的復雜性疾病，家族和遺傳因素在CHD發展過程中起到關鍵作用[3-5]。表觀遺傳學機制能很好地體現環境和基因的交互作用[6]，特別是心血管領域研究的熱點DNA甲基化，其參與了多種疾病的病理生理改變[7]。研究表明，動脈粥樣硬化的發生與DNA的異常甲基化關系密切[8]。研究發現，多數表觀遺傳學修飾具有可逆性，這種可逆性修飾為疾病的防范和治療提供了樂觀的前景。本文基于DNA甲基化/羥甲基化水平探討中藥干預對CHD血瘀證相關基因修飾調控的研究進展。

1 冠心病DNA甲基化/羥甲基化

近年來，心血管疾病被認為是受表觀遺傳學規律控制的人類重要疾病，現階段DNA甲基化在心血管領域的研究仍處于探索階段。有研究表明，基因組DNA甲基化水平異常或像MTHFR基因C677T多態性等因素造成的高同型半胱氨酸血癥，均能在早期觀察到冠狀動脈及其他動脈的粥樣硬化病變[9-12]。

動脈粥樣硬化的發生亦表明與特異性基因或相關候選基因的異常甲基化改變有關聯，如叉狀頭轉錄因子（FOXP3）基因[13]、XV型膠原α1（COL15A1）基因[14]、成纖維細胞生長因子2（FGF2）基因[15]等。遲映雪[16]研究發現，急性冠脈綜合征患者基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）基因啟動子甲基化水平與其冠狀動脈病變程度存在相關性，提示血清MMP-9可作為急性冠脈綜合征的有效生物標記物；亦有研究發現，MMP-9活性升高或高表達會加速動脈粥樣硬化的發展[17]。Ghaznavi等[18]研究表明，CHD患者組較對照組ABCA1基因甲基化頻率明顯升高，提示ABCA1基因甲基化是冠狀動脈疾病發展的重要危險因素。隨著DNA甲基化研究的深入，近幾年DNA羥甲基化的研究也逐步開展，Song等[19]研究發現，基因中5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）富集程度與低氧環境下血管生成密切相關，TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5mC）變成5hmC的過程需要氧分子。Peng等[20]研究發現，TET2介導5mC轉化5hmC，TET2的缺失與晚期動脈粥樣硬化病變相關。5hmC通過調控DNA甲基化狀態來活化抑制基因和凋亡基因，若5hmC水平降低則將因基因缺乏保護而致心腦血管疾病。大部分研究已顯示5hmC參與了基因轉錄與表達的調控過程，同時也是去甲基化過程中的一個重要中間產物[21]。5hmC雖與包括心腦血管疾病在內的多種疾病密切相關，但5hmC具體作用機制尚未明確，隨著檢測技術的改進，5hmC有望成為疾病早期診斷新的表觀遺傳標志[22]。

2 冠心病血瘀證DNA甲基化/羥甲基化

CHD屬中醫學“胸痹”范疇，其病位在心，病機關鍵在于血脈瘀阻。血瘀證是CHD最常見的證型之一[23]。關于CHD血瘀證相關基因甲基化/羥甲基化的研究已有一定進展。陳光等[24]對CHD不穩定性心絞痛血瘀證和非血瘀證患者外周血細胞中白細胞介素-6（IL-6）基因啟動子區甲基化狀態分析發現，血瘀證組患者IL-6基因啟動子甲基化水平高于非血瘀證組。唐梅森[25]研究發現，CHD血瘀證組患者ER-α和糖蛋白Ⅵ基因啟動子甲基化陽性率高于CHD痰濁證和健康人組。許多研究表明，中醫證候與DNA甲基化之間有著密切聯系。本課題組也通過研究CHD血瘀證差異表達基因的甲基化表達譜芯片發現，ER-β、CHL1、ZEB2等8個基因啟動子區甲基化狀態CHD血瘀證與健康人比較差異有統計學意義[23，26-27]。現階段中醫與CHD證候本質間的研究正在逐步深入。中醫證候本質是機體生物信號包括多個遺傳基因網絡的表達和通路調控的紊亂，但CHD血瘀證候的分子生物學本質還需進一步研究與探討。

3 冠心病相關基因甲基化修飾中藥調控分子生物學

現階段，去甲基化藥物研究還處在初級階段，且尚未能去除或減輕去甲基化藥物細胞的毒性，所以，研究中藥調控CHD相關基因甲基化修飾，從而拮抗動脈粥樣硬化的進一步發展，已成為目前研究焦點。

近年來，中藥對動脈粥樣硬化DNA甲基化的研究主要集中在中藥復方[28]。如對中藥影響DNA甲基化穩定粥樣斑塊的基礎研究表明，聯用血府逐瘀膠囊和四季三黃膠囊可增加整個基因組甲基化水平，從而降低體內三酞甘油的含量，使動脈內斑塊的穩定性得以提高，這可能是其抗動脈粥樣硬化作用的潛在機制，但具體機制還需進一步明確[29]。Wang等[30]研究發現，復方中藥補腎寧心煎能抑制細胞黏附分子，增強內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性，提高雌激素受體β的表達，抑制單核細胞趨化蛋白-1的轉錄，進而緩解動脈粥樣硬化的早期病理損傷，因此可更深入探討補腎寧心煎能否通過調控甲基化作用來干預動脈粥樣硬化的發生、發展。湯琛琛等[31]研究發現，中藥對DNA甲基化誘導的心血管疾病有逆轉作用，如姜黃素與DNA甲基化轉移酶1（DNMT1）發生共價結合從而發揮抑制DNMT的作用，降低DNA甲基化水平。有學者亦發現，姜黃素可抑制血管平滑肌細胞的增殖，機制可能與上調DNMT2的表達而引起18S rRNA基因啟動子甲基化有關[32]。在中藥治療CHD對DNA甲基化干預機制研究中發現，平肝潛陽方能升高血管平滑肌細胞的DNMT1，致使基因組整體高甲基化[33-34]。Zhou等[35]研究表明，梔子川芎膠囊可通過調節異常的高甲基化基因和低甲基化基因來治療動脈粥樣硬化，其改變的甲基化基因參與了蛋白激酶C的活性、炎性途徑、MAPK信號傳導途徑、血管內皮生長因子信號傳導途徑等。尹偉娜[36]研究發現，復方中藥通心絡能通過抑制KLF5介導的小分子核糖核酸-155表達及影響外分泌包裝蛋白LRP1和RAB27a表達來抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。任攀等[37]研究發現，當歸芍藥散可改善血脂水平、減少動脈粥樣硬化斑塊面積，具有明確的抗動脈粥樣硬化作用，其機制可能與抑制血清甲基化水平和DNMTs水平、促進斑塊體內PPARγ表達和抑制斑塊內DNMT1表達有關。

上述研究均表明，中藥可通過調節全基因甲基化水平或調節某些特定的基因干預CHD相關基因甲基化/羥甲基化修飾[33]。中醫藥在防治CHD中具有獨特的優勢，將表觀遺傳學及分子生物學技術引入中醫藥領域，不但可了解中醫藥的分子作用機制，還可為CHD臨床治療提供新方法。

4 冠心病血瘀證相關基因甲基化修飾中藥調控分子生物學

血瘀證作為CHD最常見證型之一，其病因病機等已有深入的客觀化研究，特別是隨著基因組學研究的迅猛發展，把基因組學融入中醫學在不斷深入。中藥是中醫學中不可或缺的部分，通過中藥影響和靶向調控CHD血瘀證的相關基因表達及甲基化修飾，從而影響或阻止血瘀證的發生和發展值得深入研究。

部分研究已表明，中藥干預能調控CHD血瘀證相關基因的甲基化修飾，從而影響或阻止動脈粥樣硬化的發展。如黃海波[38]臨床研究發現，養心通脈方干預家系CHD血瘀證患者能使ZEB2基因的DNA甲基化的調控顯著下降，影響動脈粥樣硬化的發生發展，證明ZEB2基因與家系CHD血瘀證存在相關性，且養心通脈方對CHD血瘀證緩解期療效更顯著。程修平等[39]用穩斑湯聯合西藥對比單純西藥治療急性冠脈綜合征痰濁血瘀證患者，治療組患者中醫證候積分顯著降低，臨床療效總有效率明顯高于對照組，其作用機制可能與降低血漿血栓調節蛋白基因啟動子甲基化水平相關。向忠軍[27]研究發現，加減養心通脈方能對CHD血瘀證3個亞型的肌間線蛋白（DES）基因表達有明顯的調控，進一步證實DES基因的甲基化修飾是CHD血瘀證的發病機制之一。

上述研究均表明CHD血瘀證與相關基因DNA異常甲基化水平相關，通過中藥干預，能明顯調控DNA的甲基化水平，通過單體化合物或化學成分群作用于DNA甲基化酶，從而逆轉疾病導致的DNA異常甲基化。但現階段通過中藥干預探討CHD血瘀證相關基因DNA甲基化改變的研究較少，中藥對血瘀證易感基因的表觀遺傳調控機制還需更深入的研究。許多學者已觀察到中醫理論與DNA甲基化之間的關聯，但揭示中藥多靶點優勢及中醫理論科學性的關鍵在于是否中藥作用強度和方式為多組分有序調控，是否能研究出血瘀證DNA甲基化改變的易感基因相對應的中藥治療方法敏感的標志物，是否能通過以方測證探討CHD血瘀證的特異性調控基因。因此，單味中藥及復方的活性組分調控DNA甲基化是否涉及中醫特色治療、外界環境因素對DNA甲基化調控基因表達的表觀遺傳調控機制等，仍需更深入的研究。

5 小結及展望

中醫藥對表觀遺傳學調控的研究尚處于早期和不成熟階段。中醫藥表觀遺傳學不但闡述證候與相關DNA甲基化酶的關系，而且驗證中藥治療可逆轉DNA的異常甲基化。可遺傳和可逆性是表觀遺傳學的兩大特點，通過外部環境干預，可多方位、全面作用和調控遺傳基因的功能和特性。這也與中醫藥治療疾病時的全面性、多靶點性有相似之處。為使中醫藥和表觀遺傳學兩者共同發展，需從中醫藥的思路和中藥驗方去探討和發現表觀遺傳調控規律，使兩學科發展相互促進，即以DNA甲基化作為CHD血瘀證新的診療工具，利用其修飾上的可逆性，通過中藥外界環境干預手段尋找到有效的干預或調控靶點，將為中醫證候本質研究提供一個新的突破點和方向標。

總之，CHD血瘀證相關基因甲基化/羥甲基化修飾的調控機制還需更深入的研究和探討，以方測證，從一些CHD血瘀證候選基因DNA甲基化/羥甲基化入手，找到其相關生物通絡作用，從基因表達-中藥干預的系統生物學角度來把握CHD基因的表觀遺傳與臨床應用結合點，以期發現中藥對CHD血瘀證甲基化/羥甲基化修飾的調控機制，闡明中藥干預CHD血瘀證的主要危險基因表達的調控靶點，為中醫藥預防和促進CHD血瘀證的臨床治療提供新思路。

[1] BENJAMIN E J, VIRANI S S, CALLAWAY C W, et al. Heart disease and stroke statistics-2018 update： A report from the American Heart Association[J]. Circulation,2018,137(12)：e67-e492.

[2] ZHAO D, LIU J, WANG M, et al. Epidemiology of cardiovascular diseasein China：current features and implications[J]. Nat Rev Cardiol,2019,16(4)：203-212.

[3] 陳悅,李杰,陳伶利,等.冠心病血瘀證與DNA甲基化/羥甲基化關系及研究進展[J].湖南中醫藥大學學報,2018,38(9)：1077-1081.

[4] INOUYE M, ABRAHAM G, NELSON C P, et al. Genomic risk prediction of coronary artery disease in 480,000 adults：implications for primary prevention[J]. J Am Coll Cardiol,2018,72(16)：1883-1893.

[5] 胡鳴穎,徐耕.冠心病遺傳變異研究方法的進展[J].心腦血管病防治, 2015,15(5)：401-405.

[6] MAHROOZ A, MACKNESS M, BAGHERI A, et al. The epigenetic regulation of paraoxonase 1 (PON1) as an important enzyme in HDL function：The missing link between environmental and genetic regulation[J]. Clin Biochem,2019,73：1-10.

[7] LI B, FENG Z H, SUN H, et al. The blood genome-wide DNA methylation analysis reveals novel epigenetic changes in human heart failure[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(8)：1828- 1836.

[8] HAI Z, ZUO W. Aberrant DNA methylation in the pathogenesis of atherosclerosis[J]. Clin Chim Acta,2016,456：69-74.

[9] KIM M, LONG T L, ARAKAWA K, et al. DNA methylationas a biomarker for cardiovascular disease risk[J]. PLoS One,2010,5(3)：e9692.

[10] LI J J, LI Q, DU H P, et al. Homocysteine triggers inflammatory responses in macrophages through inhibiting CSE-H2S signaling via DNA hypermethylation of CSE promoter[J]. Int J Mol Sci,2015, 16(6)：12560-12577.

[11] 賴偉華,潘偉祥,馮穎青,等.MeDIP-Seq法檢測冠心病患者全基因組甲基化譜[J].中國藥房,2015,26(35)：4938-4941.

[12] 付龍,孫溢晗,張月蘭.MTHFR基因C677T多態性與H型高血壓合并冠心病患者HCY、冠狀動脈病變的關系[J].中國醫科大學學報,2015, 44(4)：351-356.

[13] JIA L, ZHU L, WANG J Z, et al. Methylation of FOXP3 in regulatory T cells is related to the severity ofcoronary artery disease[J]. Atherosclerosis,2013,228(2)：346-352.

[14] CONNELLY J J, CHEREPANOVA O A, DOSS J F, et al. Epigenetic regulation of COL15A1 in smooth muscle cell replicative aging and atherosclerosis[J]. Hum Mol Genet,2013,22(25)：5107-5120.

[15] YANG T C, CHEN Y J, CHANG S F, et al. Malondialdehyde mediates oxidized LDL-induced coronary toxicity through the Akt-FGF2 pathway via DNA methylation[J]. J Biomed Sci,2014,21：11.

[16] 遲映雪.中西醫結合治療對痰濁血瘀型ACS患者MMP-9基因啟動子甲基化水平的影響[D].沈陽：遼寧中醫藥大學,2015.

[17] 李敏,孫楊,邱瑞瑾,等.冠心病相關中醫證候DNA甲基化研究進展[J].中國中西醫結合雜志,2019,39(4)：509-512.

[18] GHAZNAVI H, MAHMOODI K, SOLTANPOUR M S. A preliminary study of the association between the ABCA1 gene promoter DNA methylation and coronary artery disease risk[J]. Mol Biol Res Commun,2018, 7(2)：59-65.

[19] SONG C X, SZULWACH K E, FU Y, et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine[J]. Nat Biotechnol,2011,29(1)：68-72.

[20] PENG J, YANG Q, LI A, et al. Tetmethylcytosine dioxygenase2 inhibits atherosclerosis via upregulation of autophagy in ApoE-/-mice[J]. Oncotarget,2016,7(47)：76423-76436.

[21] 劉保東,汪海林.真核生物基因組DNA甲基化和去甲基化分析[J].生命科學,2018,30(4)：374-382.

[22] GILAT N, TABACHNIK T, SHWARTZ A, Single-molecule quantification of 5-hydroxymethylcytosine for diagnosis of blood and colon cancers[J]. Clinical Epigenetics,2017,9(1)：70.

[23] 李琳,李杰,胡志希,等.早發冠心病血瘀證與血管緊張素轉化酶基因單核苷酸多態性的相關性研究[J].中國中西醫結合雜志,2015,35(6)：686-690.

[24] 陳光,何浩強,劉詠梅,等.冠心病不穩定性心絞痛血瘀證患者IL-6基因甲基化研究及方法探討[J].中國實驗方劑學雜志,2017,23(19)：23-27.

[25] 唐梅森.基于DNA單核苷酸多態性和甲基化修飾探討早發冠心病血瘀證的相關易感基因的研究[D].長沙：湖南中醫藥大學,2015.

[26] TANG M S, HUANG Z D, XIANG Z J, et al. Research into relationship between estrogen receptor geneβpromoter regionmethylation status and blood stasis syndrome of premature coronary heart disease[J].中華中醫藥雜志,2015,30(5)：1464-1466.

[27] 向忠軍.基于甲基化修飾探討加減養心通脈方對冠心病血瘀證及亞型CTNNB1、DES基因表達的影響研究[D].長沙：湖南中醫藥大學,2015.

[28] 鄭靜,金國琴.中藥對衰老相關性疾病DNA甲基化的作用[J].中藥藥理與臨床,2017,33(3)：211-214.

[29] 康群甫,劉衛紅,任攀,等.活血解毒中藥對動脈粥樣硬化小鼠血清PGI2/TXA2及DNA甲基化水平的干預作用[J].北京中醫藥,2016,35(4)：309-314.

[30] WANG L, QIU X M, HAO Q, et al. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptorβ mediacing nitric oxide production and NF-κB suppression in endothelial cells[J]. Cell Death Dis,2013,4：1-13.

[31] 湯琛琛,劉亞敏,石玉琳,等.中藥調控DNA甲基化修飾的研究進展[J].中國醫藥導報,2017,14(18)：30-33.

[32] ANNA L, MACIEJ W, WIOLETA G, et al. Curcumin induces oxidation-dependent cell cycle arrest mediated by SIRT7 inhibition of rDNA transcription in human aortic smooth muscle cells[J]. Toxicology Letters,2015,233(3)：227-238.

[33] 武慶娟,李軍.miRNA及DNA甲基化與中藥干預冠心病機制研究進展[J].世界中西醫結合雜志,2019,14(3)：437-440.

[34] 鐘廣偉,萬玲,王東生,等.平肝潛陽方含藥血清對血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞增殖、遷移及DNA甲基化水平的影響[J].中國中西醫結合雜志,2016,36(5)：580-585.

[35] ZHOU Q B, WU L Q, ZHANG Y, et al. Effects of Zhizi Chuanxiong Capsule on the abnormal methylation in rabbits with atherosclerosis[J]. Chin J Integr Med,2018,24(7)：512-517.

[36] 尹偉娜.KLF5介導miR-155的表達和分泌以及通心絡的干預作用[D].石家莊：河北醫科大學,2016.

[37] 任攀,康群甫,周明學,等.當歸芍藥散對動脈粥樣硬化小鼠的干預作用及DNA甲基轉移酶1和PPAR-γ表達的影響[J].環球中醫藥,2017, 10(11)：1328-1332.

[38] 黃海波.養心通脈方對早發冠心病血瘀證家系CHL1、ZEB2基因甲基化作用影響的研究[D].長沙：湖南中醫藥大學,2015.

[39] 程修平,宮麗鴻,李楠,等.穩斑湯輔助治療對急性冠狀動脈綜合征痰濁血瘀證患者血漿血栓調節蛋白基因啟動子甲基化的影響[J].中醫雜志,2016,57(2)：140-144.

Research Progress in Molecular Biology of TCM Regulating Coronary Heart Disease with Blood Stasis Syndrome-related Genes Based on DNA Methylation/Hydroxymethylation Levels

ZHANG Shumeng, CHEN Lingli, ZHANG Xiangzhuo, ZENG Xueqin, ZHANG Mengxue, LI Xianfu, JIANG Yujie, LI Jie

Coronary heart disease is a complex disease with multi-gene heredity and environmental factors. Blood stasis syndrome is one of the common syndromes. Epigenetics is currently a hotspot in the field of cardiovascular research. Epigenetic mechanisms can explain the interaction between genes and the environment. The occurrence and development of coronary heart disease is closely related to the abnormal methylation of DNA, while modifications are reversible. This article used DNA methylation as a new diagnosis and treatment tool of coronary heart disease with blood stasis syndrome, discussed the research progress of regulating the gene hydroxymethylation modification of coronary heart disease with blood stasis syndrome through TCM intervention, and also provided a new thoughts for the study of TCM syndrome essence.

coronary heart disease; blood stasis syndrome; TCM intervention; DNA methylation; DNA hydroxymethylation; review

R2-05；R259.433

A

1005-5304(2020)11-0141-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005437

國家自然科學基金（81673963、81874375）；湖南省自然科學基金（2018JJ2298）；湖南省教育廳重點項目（16A160）；湖南省教育廳科研項目重點項目（60011120）；湖南中醫藥大學中西醫結合一流學科開放基金（2018ZXYJH23）

李杰，E-mail：317768870@qq.com

（2020-05-24）

（2020-06-01；編輯：華強）