紫菟二仙湯對雷公藤多苷致早發性卵巢功能不全大鼠卵巢結構與功能的影響*

顧燕頻 王荷丹 劉 瑋 呂 雯

浙江省立同德醫院 浙江 杭州 310012

早發性卵巢功能不全(POI)：指女性在40歲之前以停經或月經稀發4個月伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，間隔＞4周連續兩次FSH＞25U／L為診斷標準的卵巢活動衰退的臨床綜合征[1]。POI影響女性的生殖與心理健康，如果能做到早診斷、早發現、早治療，具有重要的臨床意義。近年來，臨床發現抗苗勒管激素（AMH）及血清抑制素B（INH-B）為卵巢儲備功能評估提供重要的參考價值[2-4]。紫菟二仙湯為我科臨床驗方，具有改善患者臨床癥狀，降低患者Kupperman評分，顯著降低FSH(P＜0.05)，提高卵巢功能的作用[5]。本研究采用雷公藤多苷建立藥物性所致POI大鼠模型，動態觀察紫菟二仙湯不同劑量對大鼠卵巢的組織病理學和AMH、INH-B等內分泌指標的影響，為深入研究中醫藥防治POI提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：10周齡健康雌性SD大鼠，體質量200g左右，購自浙江醫學科學院實驗動物中心(許可證號：SCXK浙2019-0002)。飼養于浙江省醫學科學院SPF級動物實驗室。大鼠入室后適應1周，連續5～7d行陰道涂片判斷動情周期，選取有規律動情周期的120只大鼠作為實驗動物。

1.2 實驗藥物及試劑：雷公藤多苷片購于上海復旦復華，補佳樂購于拜耳，達芙通購于雅培，紫菟二仙湯（紫河車3g，菟絲子15g，仙茅、仙靈脾、當歸、知母、炒黃柏各12g，郁金6g）購于江陰天江藥業有限公司。ELISA試劑盒購于美國OminmAbs公司。

1.3 模型制備與分組：隨機選取100只大鼠應用雷公藤多苷片50mg/kg灌胃法制作POI動物模型，連續給藥14天。藥后隨機分為模型組（M組）、西藥組（X組）、紫菟二仙湯低劑量（L組）、中劑量（Z組）和高劑量（H組）5組。各藥物組劑量按大鼠與人體表面積轉換系數計算。西藥組予補佳樂0.1mg/kg+達芙通1.8mg/kg溶于生理鹽水灌胃。中劑量組為紫菟二仙湯人體常規服用劑量轉換，低劑量組為中劑量組一半量，高劑量組以2倍中劑量給藥。20只大鼠作為空白對照組（N組），M組及N組以等體積生理鹽水灌胃。給藥3周及9周后分別采集各組數據。

1.4 一般情況觀察：每天下午13時觀察生命體征、進食、排便、行為變化和毛色變化等。

1.5 血清中FSH、E2、AMH及INH-B含量測定：各組大鼠分別給藥3w、9w后，每組大鼠隨機取10只。稱取大鼠體質量，10%水合氯醛以3ml/kg劑量麻醉大鼠。麻醉后開腹，腹主動脈取血，靜置4h后，3000r/min離心15min，分離血清，液氮凍存，-80℃儲存。ELISA法按照FSH、E2、AMH及INH-B試劑盒說明書操作，并保證標準曲線R2＞0.99。

1.6 卵巢及子宮組織光鏡觀察：各組取2只大鼠用于形態學實驗。取血后摘取大鼠雙側卵巢、子宮，加入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規 HE染色，做病理切片。置光學顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢及子宮的形態變化。

1.7 統計學方法：采用SPSS 23.0統計分析軟件，呈正態分布的計量資料均用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析進行LSD檢驗，兩組間比較采取獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較：用藥3w后，各組大鼠進食、排便、行為變化和毛色變化未見明顯變化。用藥9w后，與N組相比，M組進食、排便、行為變化和毛色變化未見明顯變化。與M組相比，中藥組大鼠進食較多，毛色光亮。

2.2 各組大鼠卵巢組織形態學觀察：N組：3w及9w卵巢皮髓質結構清晰，可見各期卵泡，形態結構正常。間質未見明顯炎細胞浸潤及纖維化。M組：3w的卵巢結構紊亂，各級卵泡較正常少，外形扭曲，卵泡顆粒細胞層較正常減少，排列紊亂，可見較多的間質、纖維血管等。9w的卵巢各級卵泡較正常明顯減少，發育成熟的卵泡更少，卵巢組織結構排列紊亂，卵巢間質可見較多淋巴細胞及漿細胞，浸潤。X組：3w及9w各級卵泡可見，發育成熟卵泡較多。卵泡顆粒細胞層較M組增多，排列較緊致，卵泡液豐富。L組：3w及9w可見各級卵泡較正常減少，有卵泡破碎產生顆粒細胞小巢或條索，卵巢組織結構排列紊亂，卵巢間質可見淋巴細胞及漿細胞浸潤。Z組：3w的卵巢可見各級卵泡，但卵巢結構紊亂，卵泡發育較M組成熟，卵泡顆粒細胞層較M組增多。9w可見各級卵泡，卵巢結構較正常，卵泡形態較規則，卵泡液豐富。H組：3w及9w皆可見各級卵泡，發育成熟卵泡較多，卵泡顆粒細胞層較M組增多。

2.3 各組大鼠子宮組織形態學觀察：除3w及9w的M組子宮內膜不連續，其余各組大鼠子宮內膜完整，組織排列整齊，未見明顯異常。

2.4 各組大鼠血清FSH及E2含量比較：3w：與N組相比，M組的FSH含量顯著升高，E2明顯降低（P＜0.05）；與M組相比，X組、Z組及H組FSH明顯下降，E2升高（P＜0.05）。與H組相比，L組血清FSH升高、E2含量降低（P＜0.05），Z組血清FSH表達有所升高（P＜0.05）。9W：與N組相比，M組的FSH含量進一步升高，E2顯著降低（P＜0.05）；與M組相比，X組、紫菟二仙湯3組FSH含量下降，E2含量升高（P＜0.05）。與H組相比，L組血清FSH升高、E2含量降低（P＜0.05），Z組血清FSH表達有所升高（P＜0.05）。紫菟二仙湯L、Z及H組在降低血清FSH、提高E2含量上成正比。與3w相比，9w的M組FSH含量有所升高，E2進一步降低（P＜0.05）；其余各組組間比較不具有統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠FSH及E2比較（±s）

表1 各組大鼠FSH及E2比較（±s）

注：與N組比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與3w比較，△P＜0.05；與H組比較，&P＜0.05。

組別9w 88.73±11.45#52.49± 8.66*△&78.70±4.57*#63.76±5.38*#&76.07±9.17*#80.64±6.39*#例數FSH（IU/L）N組M組X組L組Z組H組10 10 10 10 10 10 3w 2.35±0.19#3.37±0.40*&2.60±0.32#3.44±0.63*&3.07±0.54*#&2.57±0.43#9w 2.57±0.11#4.47±0.43*△&2.81±0.34#3.90±0.37*#&3.21±0.57*#&2.78±0.34#E2（pg/ml）3w 92.09±11.91#&63.13±6.03*&83.89±8.07*#67.54±11.86*72.22±9.57*#79.53±6.23*#

表2 各組大鼠AMH及INH-B比較（±s）

表2 各組大鼠AMH及INH-B比較（±s）

注：與N組比較，*P＜0.05；與M組比較，#P＜0.05；與3w相比，△P＜0.05；與H組比較，&P＜0.05。

組別9w 12.57±1.19#&6.20±1.99*△&9.59±1.79*#8.43±1.37*#9.50±1.60*#9.56±1.16*#例數N組M組X組L組Z組H組10 10 10 10 10 10 AMH（pg/ml）3w 1245.72±111.50#&960.20±68.40*&1123.05±96.83*#989.63±54.41*&1101.89±121.96*#1119.23±136.8*#9w 1292.01±85.33#862.15±74.81*△&1174.62±133.86*#1024.30±122.36*#&1135.79±160.66*#1181..20±169.19*#INH-B（pg/ml）3w 11.73±1.49#&7.75±1.56*&9.34±1.80*#8.11±0.84*&8.71±1.06*9.72±1.56*#

2.5 各組大鼠血清AMH及INH-B含量比較：3w：與N組相比，M組的AMH及INH-B含量顯著下降（P＜0.05）；與M組相比，X組、Z組及H組AMH升高（P＜0.05），X組及H組INH-B含量提高（P＜0.05）。與H組相比，L組AMH及INH-B含量降低（P＜0.05）。9w：與N組相比，M組AMH及INH-B含量進一步降低（P＜0.05）；與M組相比，X組、紫菟二仙湯3組AMH及INH-B含量升高明顯（P＜0.05）。與H組相比，L組血清AMH含量降低（P＜0.05）。L組、Z組及H組在提高血清AMH及INH-B含量上成正比。與3w相比，9w的M組AMH及INH-B含量進一步降低（P＜0.05）；其余各組組間比較不具有統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

40歲以下女性出現月經紊亂伴或不伴有潮熱、盜汗、失眠、易怒等不同的臨床癥狀，是卵巢功能減退的表現。此過程是一個動態的過程，其終末狀態為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。明確POF的診斷對患者會產生巨大的心理沖擊，對其生育能力的保存提出了巨大的挑戰[6]。POI概念的提出讓我們更早一步認識到本病的危害性，POI的預防和早期治療比POF形成后的治療可能更有意義[7-8]。

目前AMH聯合INH-B評估卵巢儲備功能在臨床工作中的價值日益加重[2-4]。本研究結果顯示：與N組相比，M組血清AMH、INH-B及E2水平顯著下降，FSH水平顯著升高（P＜0.05）。且M組大鼠血清AMH及INH-B水平隨飼養時間的延長進一步下降，一方面說明藥物作用下卵巢功能損傷與時間因素具有密切聯系，另一方面說明AMH聯合INH-B在動物實驗研究上亦是敏感的參考值。在組織形態學上，M組卵巢組織顯示卵巢成熟卵泡少，卵泡顆粒細胞層較正常減少，排列紊亂，卵巢間質可見淋巴細胞及漿細胞浸潤，但子宮組織未見明顯變化，結合卵巢功能指標，說明POI大鼠模型制作成功。

POI依據其臨床表現，可歸屬于中醫學“閉經”“不孕”“經水早斷”“血枯”“婦人臟躁”等范疇。《黃帝內經》曰：“五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮。六七，三陽脈衰于上，面皆焦，發始白。七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。”這一過程說明女性生殖功能與年齡有著密切的關系。腎藏精，主生殖，肝藏血，主疏泄，腎虛肝郁是本病根本病機。二仙湯具有補腎陽、滋腎陰、調和陰陽之功效，我科在此方基礎上加入血肉有情之品紫河車、補肝益腎的菟絲子、清心解郁化瘀的郁金組成了紫菟二仙湯，通過在長期臨床工作驗證其具有改善患者臨床癥狀，提高卵巢功能的作用[5]。現代藥理學研究發現紫河車中具有改善子宮內膜容受性，提高超排卵大鼠妊娠率的作用[9]。菟絲子醇提取物可提高腎陽虛證大鼠血清IgM和IgG水平，調節其免疫功能的作用[10]。本研究動態觀察發現：中、高劑量組的紫菟二仙湯可不同程度改善POI大鼠的卵巢結構，且具有提高AMH、INH-B及 E2含量，降低FSH含量（P＜0.05）。說明紫菟二仙湯具有改善卵巢結構，提高卵巢功能的作用。

綜上所述，紫菟二仙湯具有改善卵巢結構，并通過提高血清AMH、INH-B等敏感指標說明其改善卵巢功能的作用。如能進一步研究明確其改善POI作用機制，則將更有利于充分發揮中醫藥治療POI的優勢和特色。