五種蛋白酶對牡蠣酶解產物滋味特性的影響

楊 昭,姚玉靜,黃佳佳,梁志理,梁瑞進,陳麗珊,梁健平

(廣東食品藥品職業學院食品學院,廣東廣州 510520)

牡蠣(oyster)又名生蠔、海蠣子等,是一種低脂肪高蛋白的海產品,其肉嫩味鮮,營養豐富,是我國重要的大宗水產品[1]。近年來研究報道牡蠣及其酶解產物具有抑菌、抗疲勞、抗氧化、降血脂、降血壓等多種生理活性,因此在功能性食品開發領域具有極高的應用價值[2-3]。基于牡蠣酶解產物良好的功能,運用蛋白質酶解技術處理牡蠣制備呈味肽和生物活性肽,獲得越來越多學者的關注[4-5]。

蛋白質酶解是復雜的過程,受多種因素的影響,如蛋白質種類、酶的種類、酶解條件(料液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時間)和酶滅活條件[6]。其中蛋白質種類和酶的種類是影響酶解產物組成的重要因素,不同的蛋白酶有不同的酶切位點,會引起酶解產物氨基酸組成、肽的結構和肽分子量的差別。探究蛋白酶種類對牡蠣酶解產物的影響顯得尤為重要。馮丹丹等[7]研究了菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶對太平洋牡蠣的氨基態氮、總酸、礦質元素及牛磺酸含量的影響。侯清娥[8]采用胃蛋白酶、Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、動物蛋白酶、風味蛋白酶酶和復合酶在相同條件下分別對牡蠣蛋白進行水解6 h,考察了不同蛋白酶對牡蠣酶解產物水解度、感官、蛋白質利用率、肽含量和肽分子量分布的影響。然而,上述研究中不同蛋白酶的酶解產物水解度是不同的。水解度是衡量水解程度的重要指標。酶解產物水解度不同,其肽分子量分布和游離氨基酸含量必然不同。因此無法判斷酶解產物的特性差異是蛋白酶種類引起的,還是水解度不同引起的。為考察不同蛋白酶對牡蠣酶解產物滋味特性的影響,篩選合適的水解蛋白酶,有必要在水解度一致的條件下對比蛋白酶對酶解產物特性的影響,但目前未有相關文獻報道。

本研究以牡蠣為原料,通過控制水解時間,獲得水解度一致的酶解產物,探究五種常用商用蛋白酶(胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶)對酶解產物感官、肽分子量和游離氨基酸的影響,以期為牡蠣酶解產物在保健食品領域的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣 購于廣州黃沙水產市場,開殼取肉,攪碎均勻后分裝于封口袋中,-18 ℃凍藏備用;風味蛋白酶(500 LAPU/g) 諾維信中國公司;堿性蛋白酶(20萬U/g)、胰蛋白酶(4000 U/g)、動物蛋白酶(4000 U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g) 重慶市全新祥盛生物制藥有限公司;卵清蛋白(43000 Da)、細胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6512 Da)、維生素B12(1355 Da) 美國Sigma-Aldrich公司;其他試劑 均為分析純。

s220型pH計 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;3K15型臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;TLE104E型分析天平 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;DKZ-3B型水浴振蕩培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;K9840型凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津制作所;L8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五種蛋白酶水解制備牡蠣酶解產物 牡蠣酶解產物制備參照姚玉靜等[9]的方法略有修改。凍藏牡蠣原料置于室溫解凍后,根據原料的質量按照1∶1的比例加入相應重量的蒸餾水,攪拌均勻。依據表1各種蛋白酶的酶解條件進行水解,用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液或0.05 mol/L鹽酸溶液調節pH至各種酶最適pH。酶解結束后沸水浴20 min滅酶,8000 r/min離心20 min,取上清液即為酶解產物,-18 ℃凍存備用。

表1 五種蛋白酶水解條件Table 1 The hydrolysis conditions of five proteases

1.2.2 水解度測定 氨基酸態氮含量依據甲醛滴定法測定[10]。總氮含量依照《GB 5009.5-2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定 第一法 凱氏定氮法》。水解度(degree of hydrolysis,DH)按下列公式計算:DH(%)=(酶解液中氨基酸態氮含量-原料中氨基酸態氮含量)/原料中總氮含量×100

1.2.3 感官評價 參照姚玉靜等[10]的方法進行感官評價。選取7名經過篩選和滋味培訓的食品專業學生作為感官評定員(3名男性、4名女性)。滋味標準品分別是鮮味(0.2%味精),甜味(1%蔗糖),咸味(0.35%食用鹽),酸味(0.04%檸檬酸),苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)。使用5點線性坐標,將標準品梯度稀釋,最高濃度為10分,最低濃度為2分,每稀釋1個梯度,感官分值降低2分。酶解液稀釋3倍,采用感官定量分析對酶解產物進行感官評價。

1.2.4 肽分子量分布測定 參照張杰等[11]的方法略有修改。將酶解產物稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL,經過0.22 μm微濾膜,使用高效液相色譜測定樣液中肽分子量分布。色譜柱:TSk gel G2000 SWxL(300 mm×7.8 mm,5 μm),檢測波長:220 nm,柱溫箱溫度:30 ℃,流動相:超純水∶乙腈∶三氟乙酸=55∶45∶0.1(體積比),流速:1 mL/min,進樣量:10 μL。將4種肽標準品(卵清蛋白、細胞色素C、抑肽酶、維生素B12)配制成1 mg/mL溶液,進行高效液相色譜洗脫。根據出峰時間和分子量大小的對數值作肽分子量標準線性回歸方程為y=-0.3109x+6.9925(R2=0.9932),劃分出>10、5～10、3～5、1～3和<1 kDa五個分子量段對應的保留時間段,對色譜曲線進行保留時間積分求得酶解液中不同分子量段。

1.2.5 游離氨基酸組成測定 根據《GB 5009.124-2016 食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》進行酶解產物氨基酸組成測定。

1.2.6 游離氨基酸滋味貢獻評價 采用呈味強度值(Taste Activity Value,TAV)評價單個游離氨基酸對酶解產物滋味的貢獻,即樣品中各呈味物質的含量與該物質味道閾值之比[12]。

1.3 數據處理

所有的實驗均進行3次。采用EXCEL 2010軟件進行統計分析,數據采用平均數±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 五種酶解產物的水解度

由圖1可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶水解牡蠣所得酶解產物水解度分別為 30.05%、30.57%、30.19%、28.68%和29.00%,均在30%左右,表明5種蛋白酶酶解產物水解度基本一致。可為后續酶解產物感官評價、肽分子量和游離氨基酸的分析提供水解度一致的條件,規避水解度的影響。

圖1 五種酶解產物的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of five hydrolysates

2.2 五種酶解產物的感官評價

呈味基料具有味道鮮美、營養豐富、口感飽滿和特征風味濃郁的特點[13]。牡蠣酶解產物作為應用前景廣闊的呈味基料,必須具有較佳的感官品質才能有廣泛的應用。鮮味和甜味可賦予較佳的感官品質,而苦味一般認為滋味較差。由圖2可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產物鮮味評分分別為10.0、9.3、9.7、9.3 和10.0,表明5種酶解產物均具有較強的鮮味。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產物甜味評分分別為8.7、8.0、8.7和9.3。表明胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶的酶解產物具有較強的甜味,而中性蛋白酶酶解產物的甜味評分最低。五種酶解產物苦味評分均較低,其中胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解產物苦味評分均為2.0。堿性蛋白酶酶解產物酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味評分分別為3.7、8.7、2.0、7.3和9.7,在五種酶解產物中整體感官評價較佳,呈現出貝類風味突出,強烈鮮味,甜味明顯,咸味濃厚,弱酸味和苦味。侯清娥[8]在研究中也發現牡蠣經過不同蛋白酶酶解后,酶解產物表現出較強的鮮味。

圖2 五種酶解產物的滋味特性雷達圖Fig.2 Taste characteristic radar map of five hydrolysates

2.3 五種酶解產物的肽分子量分布

小分子肽對酶解產物滋味有重要影響。通常認為分子量<5 kDa的肽可能會顯現出酸、甜、苦、咸和鮮味,而分子量>5 kDa的肽無滋味[14]。由圖3可知,五種酶解產物肽分子量分布呈現較大的差異。分子量為3～5 kDa肽比例從大到小是堿性蛋白酶(26.62%)、中性蛋白酶(23.41%)、動物蛋白酶(23.24%)、胰蛋白酶(22.74%)和風味蛋白酶(16.34%)。分子量為1～3 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(32.54%)、動物蛋白酶(31.67%)、中性蛋白酶(30.70%)、風味蛋白酶(29.50%)和堿性蛋白酶(25.33%)。分子量<1 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(19.71%)、動物蛋白酶(18.53%)、中性蛋白酶(17.42%)、堿性蛋白酶(16.50%)和風味蛋白酶(12.93%)。綜合分析,分子量<5 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(74.99%)、動物蛋白酶(73.44%)、中性蛋白酶(71.53%)、堿性蛋白酶(68.46%)和風味蛋白酶(58.77%)。表明在水解度一致的情況下,蛋白酶的種類對牡蠣酶解產物肽分子量分布有較大影響。然而,感官評價中滋味最佳的是堿性蛋白酶酶解產物,其分子量<5 kDa肽比例在五種酶解產物中不是最大。表明酶解產物的滋味特性不僅與肽比例有關,可能與肽組成和肽含量有密切關系。后續需要深入研究牡蠣堿性蛋白酶酶解產物良好滋味與小分子肽的關聯。

圖3 五種酶解產物的肽分子量分布范圍Fig.3 The range of peptide molecularweight in five hydrolysates

2.4 五種酶解產物的游離氨基酸組成及評價

表2 五種酶解產物的氨基酸組成Table 2 Free amino acids composition of five hydrolysates

游離氨基酸具有增鮮和提高機體免疫力等作用[15]。游離氨基酸也是肉類及其酶解產物重要的滋味呈味和香味前體物質[16]。由表2可知,五種酶解產物均含有16種氨基酸,其中含有7種必需氨基酸。五種酶解產物在各種氨基酸含量、游離氨基酸總量和必需氨基酸總量均存在較大差異。五種酶解產物中游離氨基酸百分比均呈現出谷氨酸百分比最高、組氨酸百分比最低的特點。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解產物中谷氨酸百分比分別為9.61%、9.86%、10.48%、12.04%和10.73%。

游離氨基酸總量從高到低為胰蛋白酶(22.816 mg/g)、中性蛋白酶(20.775 mg/g)、風味蛋白酶(20.530 mg/g)、動物蛋白酶(16.287 mg/g)、堿性蛋白酶(16.232 mg/g)。必需氨基酸總量從高到低為中性蛋白酶(7.806 mg/g)、胰蛋白酶(7.691 mg/g)、風味蛋白酶(7.466 mg/g)、堿性蛋白酶(5.979 mg/g)、動物蛋白酶(5.410 mg/g)。5種酶解產物中必需氨基酸百分比在33.22%～37.57%之間,中性蛋白酶酶解產物中必需氨基酸百分比最高為37.57%,其次為堿性蛋白酶(36.83%)。

游離氨基酸是酶解產物滋味的重要來源。可以大致把氨基酸分為鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸)、甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、色氨酸)、芳香族氨基酸(半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)[17]。通常認為鮮味氨基酸和甜味氨基酸引起愉快的滋味感受,苦味氨基酸和芳香族氨基酸引起不愉悅的滋味感受[12]。由表2可知,五種酶解產物游離氨基酸含有3種鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸)、6種甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸)、5種苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸)和2種芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)。由圖4可知,五種酶解產物游離氨基酸中鮮味氨基酸百分比從高到低分別是風味蛋白酶(23.82%)、中性蛋白酶(23.74%)、動物蛋白酶(21.83%)、胰蛋白酶(21.71%)、堿性蛋白酶(20.77%)。五種酶解產物游離氨基酸中甜味氨基酸百分比從高到低分別是風味蛋白酶(37.70%)、堿性蛋白酶(35.14%)、中性蛋白酶(35.03%)、胰蛋白酶(33.90%)、動物蛋白酶(33.81%)。五種酶解產物游離氨基酸中鮮味氨基酸+甜味氨基酸均已超過50%。

圖4 五種酶解產物呈味氨基酸百分比Fig.4 The percentage of flavor amino acids in five hydrolysates

然而,不同氨基酸的味覺閾值不同,含量高的呈味氨基酸并不一定對樣品的滋味貢獻大。目前,通常采用呈味強度值法(TAV)評價物質對樣品滋味貢獻的大小,當TAV 大于1 時,該物質對樣品呈味有重要貢獻,并且數值越大,貢獻越大。而小于1時,該物質對樣品呈味貢獻不大,呈味作用不顯著[18]。

表3 五種酶解產物游離氨基酸的TAVTable 3 Taste activity values of free amino acids in five hydrolysates

由表3可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸數量分別為10、8、8、9和11種。胰蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、5種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.06～7.31之間。動物蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸,TAV值在1.02～5.36之間。堿性蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、3種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.22～5.67之間。中性蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.22～8.34之間。風味蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸包括3種鮮味氨基酸、3種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.03～7.34之間。5種蛋白酶酶解產物中,TVA值最大的氨基酸均是谷氨酸。表明谷氨酸是五種酶解產物游離氨基酸中最主要的呈鮮物質,并且是牡蠣酶解產物鮮味滋味的重要提供者。賴氨酸是必需氨基酸,也是重要的呈鮮氨基酸。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解產物中賴氨酸TAV值分別為4.01、2.80、2.40、3.00和3.19。在5種酶解產物中,風味蛋白酶酶解產物TAV大于1的游離氨基酸數量最多,其中含有的鮮味氨基酸數量也最多。然而,感官評價最佳的是堿性蛋白酶酶解產物。表明,游離氨基酸是滋味的重要貢獻者,但不是唯一的影響因素。

3 結論

本研究采用5種典型的蛋白酶分別對牡蠣進行水解,在水解度一致的情況下,探究胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶對酶解產物感官、肽分子量和游離氨基酸的影響。結果顯示,五種酶解產物均具有較強的鮮味。堿性蛋白酶酶解產物在五種酶解產物中整體感官評價最佳。五種酶解產物分子量<5 kDa的肽比例均超過50%。分子量<5 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(74.99%)、動物蛋白酶(73.44%)、中性蛋白酶(71.53%)、堿性蛋白酶(68.46%)和風味蛋白酶(58.77%)。五種酶解產物中游離氨基酸百分比均呈現出谷氨酸百分比最高、組氨酸百分比最低的特點。游離氨基酸總量從高到低為胰蛋白酶(22.816 mg/g)、中性蛋白酶(20.775 mg/g)、風味蛋白酶(20.530 mg/g)、動物蛋白酶(16.287 mg/g)、堿性蛋白酶(16.232 mg/g)。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶酶解產物中TAV大于1的游離氨基酸數量分別為10、8、8、9和11種。5種蛋白酶酶解產物中,TVA值最大的氨基酸均是谷氨酸。牡蠣酶解產物具有復雜的滋味特性,下一步研究應針對小分子肽的呈味特性,對其進行分離鑒定,以剖析牡蠣酶解產物的滋味特征,為牡蠣酶解產物工業化應用奠定基礎。