Kokumi肽的特性及其制備研究進(jìn)展

黃煜燃,楊 娟,汪 薇,白衛(wèi)東,*,曾曉房,黃文彪,陳 杰

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225; 2.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東佛山 528500; 3.廣東粵師傅調(diào)味食品有限公司,廣東開平 529300)

食物在滿足人們基本需求的同時,也可以帶給人們心理上的愉悅享受。除了香味以外,滋味是評價食物感官質(zhì)量的最重要特性。滋味物質(zhì)通常是親水性的小分子物質(zhì),這些小分子物質(zhì)從食物提取到唾液中后,與舌頭味蕾細(xì)胞上特定味覺受體相互作用,從而產(chǎn)生各種味覺[1-2]。酸、甜、苦、咸、鮮是人們廣泛熟知的五種基本味覺[3],但隨著人們對于食物味道的追求不斷提高,單一的味覺特性已經(jīng)不能滿足人們的需求,且食物中的濃厚、飽滿圓潤、回味悠長和平衡協(xié)調(diào)等復(fù)雜特性無法用這五種基本味感來表達(dá)。早在1900年,日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了這種具有復(fù)雜味感的活性物質(zhì),并將此味感定義為“kokumi”[4]。

呈味肽一般是對食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的小分子寡肽類,根據(jù)其味覺特性又分為了酸味肽、甜味肽、苦味肽、咸味肽和鮮味肽五大類[5]。在人們的認(rèn)識中,鮮味肽的概念容易與kokumi肽混淆。研究表明,鮮味肽具有增強(qiáng)食物咸鮮味和醇厚感等特點(diǎn),但kokumi是形容更為復(fù)雜的味感,它強(qiáng)調(diào)食物的協(xié)調(diào)感、豐富度和持續(xù)度,屬于口感的范疇,這是鮮味與kokumi味感最本質(zhì)的區(qū)別[6-8]。Kokumi肽作為一種新型活性肽類物質(zhì),具有良好的味覺特性,能夠影響食品的營養(yǎng)和感官質(zhì)量[9-10],故成為近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)和新型調(diào)味劑開發(fā)的重點(diǎn)方向。

本文重點(diǎn)介紹了kokumi肽的來源、結(jié)構(gòu)特性、味覺特性以及呈味機(jī)制等特性,加深對kokumi肽的系統(tǒng)認(rèn)識和理解,并結(jié)合kokumi肽的制備方法進(jìn)行綜述,以期為kokumi肽的研究利用和進(jìn)一步開發(fā)新型調(diào)味品提供理論依據(jù)和參考。

1 Kokumi肽的來源

“Kokumi”一詞最早源自于日本,由于食品中的滋味十分復(fù)雜,無法用單一的基本味覺去描述如濃湯和發(fā)酵食品等優(yōu)良風(fēng)味。因此,人們習(xí)慣上用這一詞來表達(dá)食品的濃厚感、豐富度、持續(xù)性、協(xié)調(diào)性和飽滿圓潤等一種綜合性的味覺感受[11-12]。早在1990年,日本學(xué)者Ueda等[4]在大蒜的水提物中鑒定出賦予食品kokumi味感的物質(zhì)主要是一些含硫化合物,如大蒜堿、S-甲基-L-半胱氨酸亞砜和γ-L-谷酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸等。1994年,該學(xué)者在洋蔥提取物中同樣發(fā)現(xiàn)了如γ-谷酰基-S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜和反-S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜等具有濃厚味感的含硫化合物[13]。同年,法國學(xué)者Roudot-Algaron等[14]從Comté奶酪中分離純化了三種具有復(fù)雜、濃郁且略帶咸鮮味和金屬味的γ-谷氨酰二肽(γ-Glu-Phe、γ-Glu-Tyr和γ-Glu-Leu),并認(rèn)為這三種肽是賦予奶酪風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)。1997年,Ueda等[15]發(fā)現(xiàn),當(dāng)γ-谷胱甘肽(γ-L-Glu-L-Cys-Gly,GSH)添加到含有谷氨酸鈉(MSG)和肌苷酸(IMP)的鮮味溶液后,鮮味溶液中的口感、厚度和連續(xù)性顯著提升,并指出GSH是一種典型的kokumi肽。自此,越來越多的學(xué)者開始對kokumi肽進(jìn)行研究和開發(fā)。

近年來,在許多食品中都能發(fā)現(xiàn)kokumi肽,包括γ-谷氨酰肽和一些小分子寡肽類等,主要來源于動物性食品,如河鲀、鴨肉、扇貝、牛骨髓,植物性食品,如菜豆、大豆、雙孢蘑菇,以及發(fā)酵食品,如奶酪、發(fā)酵面團(tuán)、發(fā)酵魚、魚醬、蝦醬、醬油、酒精飲料和酵母提取物等。為了研究kokumi肽的特性,本文總結(jié)了文獻(xiàn)已報道不同來源的kokumi肽的序列和呈味閾值,如表1所示。

2 Kokumi肽的特性

2.1 Kokumi肽的結(jié)構(gòu)特性

Kokumi肽的呈味特性與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),大部分kokumi肽為γ-谷氨酰肽類物質(zhì),Wang等[38]通過將暗紋東方鲀肌肉水解物進(jìn)行超濾分級后,發(fā)現(xiàn)0.3～3 kDa組分的濃厚味感和鮮味特性比大于3 kDa組分明顯,且進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,其濃厚味感會更加強(qiáng)烈。此外,在三種酵母抽提物的kokumi物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致其濃厚味感的主要滋味物質(zhì)為<1000 kDa分子量的寡肽[23,39]。大量研究也證實(shí)了具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽類物質(zhì)幾乎都是γ-谷氨酰二肽和三肽類物質(zhì)。Kokumi肽中官能團(tuán)位置的差異也會明顯影響其呈味效果。如Toelstede等[34]研究古達(dá)奶酪中的8種α-L-谷氨酰肽和γ-L-谷氨酰二肽時發(fā)現(xiàn),只有γ-L-谷氨酰二肽具有濃厚味特性,而α-L-谷氨酰肽沒有此作用。

除此之外,部分kokumi肽的末端連接了如Val、Ala、Leu、Met和Phe等疏水性氨基酸,當(dāng)這些疏水性氨基酸殘基位于肽鏈的C-端位置時,會產(chǎn)生苦味[40],但這些kokumi肽并沒有呈現(xiàn)出苦味,反而呈現(xiàn)出濃厚、飽滿和持久的風(fēng)味特性。其原因可能是因?yàn)棣?谷氨酰化降低了肽的苦味,使它產(chǎn)生了更好的濃厚味感[41]。另一項研究也表明,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)可以降低氨基酸的苦味[42]。這說明了kokumi肽的呈味特性會受末端的疏水性氨基酸殘基影響,但并不能決定其總體的呈味效果。此外,當(dāng)肽類物質(zhì)含有Cys的肽段時,會因氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上含有-SH而在舌尖上產(chǎn)生了輕微的收斂感,因而呈現(xiàn)出更低的味感閾值和顯著的濃厚味感,說明了Cys殘基對kokumi肽的味感具有重要影響[31]。

2.2 Kokumi肽的味覺特性

Kokumi肽本身是沒有味覺活性的,幾乎所有具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽類物質(zhì)在水溶液中只會表現(xiàn)出輕微的澀味或苦味,這是由N-端的γ-谷氨酰基和C-端的氨基酸殘基決定的[41]。研究表明,γ-Glu-Val-Gly和γ-Glu-Cys-Gly在甜味、咸味和鮮味等基本味覺溶液和雞湯溶液中能顯著增強(qiáng)其基本味覺效果并呈現(xiàn)出明顯的濃厚味感[43-44]。Yang等[36-37]通過研究γ-谷氨酰肽的酶促合成和感官特性分析發(fā)現(xiàn),γ-[Glu]n-Phe、γ-[Glu](n>1)-Val和γ-[Glu](n>1)-Met單獨(dú)添加在水中時只有輕微的澀味,但當(dāng)它們被添加到商業(yè)醬油和模擬雞湯溶液中時,能夠產(chǎn)生明顯的濃厚味覺,并能顯著增強(qiáng)商業(yè)醬油和雞湯溶液的鮮味味覺。可見,只有將這些kokumi肽添加到含有兩種或三種基本味覺物質(zhì)的溶液中時才能呈現(xiàn)出濃厚味感,且能增強(qiáng)溶液中的咸鮮味感。這表明kokumi肽能有效協(xié)調(diào)其他基本味感,顯著增強(qiáng)復(fù)合溶液的厚度、豐富度和味感持續(xù)性,具有協(xié)同增效作用。

表1 食品中kokumi肽的序列、來源及呈味閾值Table 1 The sequence,source and taste threshold of kokumi peptides in food

研究表明,kokumi肽還具有劑量-濃度效應(yīng)。即在溶液中添加的kokumi肽必須達(dá)到一定濃度,才能使其表現(xiàn)出濃厚味;且由于其本身具有澀味,當(dāng)其添加濃度過高時會引起其濃厚味味覺的減退。例如,來源于酵母提取物中的kokumi肽在濃度超過其閾值濃度的16倍時,其濃厚味感開始下降,而且Ala-Val、Tyr-Glu和Ala-Tyr在濃度分別達(dá)到26.4、16.1和19.8 mmol·L-1時才開始呈現(xiàn)出濃厚味感[23]。Yang等[36-37]在對γ-[Glu]n-Phe、γ-[Glu](n>1)-Val和γ-[Glu](n>1)-Met的研究中也發(fā)現(xiàn),當(dāng)這些γ-谷氨酰肽的濃度超過3 mmol·L-1時,能產(chǎn)生鮮味和濃厚感,但當(dāng)劑量濃度超過5 mmol·L-1時,濃厚味感會減退并產(chǎn)生澀味。

2.3 Kokumi肽的呈味機(jī)制

目前的研究認(rèn)為,kokumi肽具有激活鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)的能力,從而產(chǎn)生濃厚味感[43,45,10]。CaSR位于味感細(xì)胞的膜表面,是屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體C家族的第二組成員,由1078個氨基酸殘基組成[46-47]。早在2009年,San等[46]發(fā)現(xiàn)小鼠的味感細(xì)胞中存在CaSR,并首次證實(shí)了CaSR是引起哺乳動物濃厚味感的潛在味覺組織。此后,多位學(xué)者開始研究濃厚感味覺與CaSR之間的關(guān)聯(lián)性。Kuroda等[45]研究發(fā)現(xiàn),GSH、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Abu-Gly(Abu:α-氨基丁酸)和γ-Glu-Val-Gly等物質(zhì)的濃厚味強(qiáng)度與CaSR活性呈顯著正相關(guān)。此研究還發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入CaSR特異性拮抗劑NPS-2143后,能顯著降低GSH和γ-Glu-Val-Gly的味覺強(qiáng)度,這說明CaSR參與了kokumi物質(zhì)的呈味效應(yīng)。Yutaka團(tuán)隊的研究同樣也證實(shí)了上述的結(jié)論,并且還發(fā)現(xiàn)CaSR不直接參與鮮味或甜味的信號傳遞,證明了表達(dá)CaSR的味覺細(xì)胞是區(qū)別于T1R3表達(dá)鮮味或甜味受體細(xì)胞的細(xì)胞亞群,是kokumi物質(zhì)的主要檢測器[10]。

此外,具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽的氨基酸序列可能對CaSR的激活有一定的影響。Amino等[48]通過研究具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽結(jié)構(gòu)與CaSR活性的關(guān)系中發(fā)現(xiàn),N-端為L-構(gòu)型的γ-谷氨酰殘基,且第二個殘基連接的中等大小、脂肪族中性取代基的γ-谷氨酰二或者三肽具有很強(qiáng)的激活CaSR的能力。但是,由于氨基酸的排列順序復(fù)雜多樣,單一的排列規(guī)則無法代表具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽的氨基酸序列特點(diǎn)。因此,kokumi肽的濃厚味機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3 Kokumi肽的制備方法

由于kokumi肽獨(dú)特的呈味特性,含有kokumi肽的食用調(diào)味品生產(chǎn)日益受到人們的關(guān)注。根據(jù)現(xiàn)有的研究,kokumi肽的制備方法主要分為化學(xué)合成法、酶合成法和微生物發(fā)酵法。

3.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是以氨基酸為原料,利用一系列化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行肽鍵縮合的方法。該法主要集中在二肽和三肽的合成,特點(diǎn)是純度高、穩(wěn)定性好,但操作繁瑣、反應(yīng)復(fù)雜、產(chǎn)率低、價格昂貴,且制備過程中需要用到一些合成試劑如偶聯(lián)劑和酰化試劑等,存在一定的毒副作用[49]。化學(xué)合成法多適用于純度要求極高的kokumi肽的制備,其產(chǎn)物主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的分析檢測,無法滿足kokumi肽產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。

3.2 酶合成法

目前最常見的kokumi肽為γ-谷氨酰肽,多項研究報道該類kokumi肽是由生物酶合成的。酶合成法是利用酶制劑在特定的底物和反應(yīng)條件下催化合成γ-谷氨酰肽的方法。最常用的兩種酶是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)和谷氨酰胺酶(glutaminase)。GGT屬于轉(zhuǎn)移酶,它能誘導(dǎo)γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)和谷氨酰胺的水解反應(yīng),使γ-谷氨酰基與不同的氨基酸結(jié)合生成不同的γ-谷氨酰肽,且反應(yīng)不需要消耗ATP。早在2009年,Toelstede等[50]研究發(fā)現(xiàn),對藍(lán)色脈紋奶酪具有濃厚味貢獻(xiàn)的一組γ-谷氨酰二肽是由青霉菌(Penicillium roquefortii)中的GGT參與合成的。同樣地,Hillmann等[51]利用GGT活性檢測和同位素標(biāo)記法證實(shí)了帕瑪森乳酪成熟過程中的濃厚味γ-谷氨酰二肽是由牛奶原料中的GGT催化產(chǎn)生的。另一項研究也發(fā)現(xiàn),將GGT添加到日本發(fā)酵豆醬中能顯著提高γ-Glu-Val和γ-Glu-Val-Gly的濃度,并使豆醬的鮮味和濃厚味得到提升[52]。另一種谷氨酰胺酶同樣具有合成γ-谷氨酰肽的能力。Yang等研究發(fā)現(xiàn),來源于淀粉芽孢桿菌的谷氨酰胺酶可以催化合成幾種γ-谷氨酰肽(γ-[Glu](n≤5)-Phe/Val/Met),且這些短肽都具有良好的濃厚味活性[36-37,53]。此外,Suzukit等[54]同樣證明了淀粉芽孢桿菌中的谷氨酰胺酶可以顯著增加大豆蛋白和谷蛋白水解產(chǎn)物的濃厚味感。簡言之,利用生物酶的催化特性生產(chǎn)kokumi肽,能夠克服化學(xué)合成法的產(chǎn)率低、成本高和毒副作用的缺點(diǎn),為kokumi肽的食用調(diào)味品生產(chǎn)提供良好的發(fā)展前景。

3.3 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用特定微生物代謝活動產(chǎn)生的多種酶類,使大分子蛋白質(zhì)降解生成小分子肽段的方法。最為典型具有濃厚味活性的GSH是僅有的利用酵母菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的γ-谷氨酰肽[55-56]。但是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)其他濃厚味活性的γ-谷氨酰肽仍處于初步階段。Zhao等[35]研究發(fā)現(xiàn),在面團(tuán)發(fā)酵過程中添加羅伊氏乳桿菌能顯著增加6種γ-谷氨酰二肽的含量,且當(dāng)添加不同的羅伊氏乳桿菌株時,其發(fā)酵液中的γ-谷氨酰二肽含量也會產(chǎn)生差異。此外,許多研究證實(shí)了γ-Glu-Val-Gly的形成與多種微生物有關(guān)。Kuroda等[26]推斷魚醬中γ-Glu-Val-Gly的形成可能與芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、鹽桿菌(Halobacterium)、弧桿菌(Vibrionaceae)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等的代謝活動有關(guān)。Sofyanovich團(tuán)隊[58]的研究發(fā)現(xiàn),γ-Glu-Val-Gly是釀酒酵母生理反應(yīng)的重要產(chǎn)物。另一項研究利用主成分分析同樣地證實(shí)了γ-Glu-Val-Gly的形成與嗜鹽四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcusspp.)和芽孢桿菌屬(Lentibacillusspp.)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[30]。由此可見,具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽的形成與多種微生物有關(guān),利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-谷氨酰肽同樣具有良好的前景,但是微生物發(fā)酵法所得到的γ-谷氨酰肽組成一般較為復(fù)雜,無法獲得單一的目標(biāo)γ-谷氨酰肽,分離純化微生物發(fā)酵產(chǎn)物中具有濃厚味活性的γ-谷氨酰肽是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)亟需攻克的難題。

4 結(jié)語

隨著人們生活水平的提高,對食品的風(fēng)味和質(zhì)量有了新的追求,越來越趨向于“低鹽、低糖、低脂”的健康飲食方式。Kokumi肽是繼鮮味肽之后的一種新型食品調(diào)味劑,具有增強(qiáng)食品濃厚味感、延長回味、提升食品整體協(xié)調(diào)性和豐富度的特點(diǎn),并且味覺閾值低,少量添加便能增加其他基本味感,能夠有效地減少鹽和糖等食品調(diào)味劑的使用量,符合人們追求食品天然屬性的心理需求。但是,目前我國對kokumi肽的研究開發(fā)仍處于初步階段,且停留在實(shí)驗(yàn)室的分離鑒定和kokumi肽與其它味感物質(zhì)的復(fù)合應(yīng)用研究上,對kokumi肽的制備技術(shù)尚未成熟,未能利用現(xiàn)有的生物工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)kokumi肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此,如何科學(xué)地利用酶和微生物生產(chǎn)kokumi肽,提高產(chǎn)物的獲得率和穩(wěn)定性,以及進(jìn)一步加強(qiáng)kokumi的味感特性和呈味機(jī)制的研究,并有目的地合成、改造或設(shè)計kokumi肽,對于豐富調(diào)味品種類,推動kokumi肽實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和調(diào)味品行業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。