基于單拷貝核基因的熒光定量PCR技術檢測驢奶的含量

王之瑩,李婷婷,于文杰,喬 璐,陳愛亮

(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,北京 100081)

驢在農村經濟中占有重要的地位,驢奶也具有廣泛的應用。長期以來,人們一直有飲用驢奶的習慣,不僅因為它較高的營養價值,還因為它的藥用價值,能夠預防動脈粥樣硬化、緩解牛奶蛋白過敏患者的過敏反應[1-2]。在歐美,驢奶不但是生物制劑的加工原料,更是一種流行的保健飲品。在我國,雖然有很多人飲用驢奶,但鑒于我國的產驢地區主要位于西北偏遠地帶,而奶制品保質期較短,運輸困難,因此即使新疆每年可產驢奶4萬噸,而實際用于加工的驢奶非常少,造成這一資源的巨大浪費[3]。最重要的是,目前國內尚缺乏規模完整的驢奶加工廠,市場上銷售的驢奶大多源于家庭作坊,加之,與其他高營養價值的奶制品一樣,驢奶的價格(80～150 元/kg)[4]相對于牛奶(約10.60 元/kg)[5]較為昂貴,從而導致驢奶成為摻假的潛在目標。出于安全考慮,飲用摻假的驢奶會危害到牛奶蛋白過敏患者的身體健康[6],因此,需要一種能夠快速、靈敏地檢測驢奶含量的方法,確定其是否摻假及摻假比例。

目前,物種鑒定技術主要是基于蛋白質和基于核酸的方法。基于蛋白質的檢測技術包括高效液相色譜[7]、光譜技術[8]以及酶聯免疫吸附測定[9],這些技術雖然測得的結果準確,但操作繁瑣且需要昂貴的儀器。此外,蛋白質在加工過程中容易變性,因此在檢測加工乳制品時,會降低其方法的靈敏度[10]。相比之下,DNA具有較高的穩定性,使得核酸檢測技術成為物種鑒定中最常用的技術,包括普通的聚合酶鏈反應(PCR)[11]、熒光定量PCR[12]和等溫擴增技術[13]。定性PCR比較常見,但它只能檢測物種的種類,而定量PCR可以判斷摻假的比例[14]。當前已有許多關于定量PCR的研究,但這些研究主要集中在線粒體基因[15],而線粒體基因在不同的物種或者組織中具有高變異性和多拷貝數,這一特點會導致定量分析存在測量誤差[16]。

表1 驢特異性引物和內參引物的序列Table 1 Sequences of donkey-specific primers and reference primers

為了解決這一問題,本研究篩選了單拷貝核基因作為驢的特異性基因和通用性的內參基因,該基因在不同的物種或者組織中具有穩定且恒定表達的拷貝數(一個或者幾個拷貝)[17-18]。同時,內參基因在不同的生物體或者細胞中能夠穩定表達,從而避免物種間多樣性的干擾[19]。本文旨在開發一種標準化熒光定量PCR方法來定量待檢的滅菌乳樣品中驢奶的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

驢奶 新疆烏魯木齊縣南山哈薩克牧場;牛奶 呼倫貝爾陳巴爾虎旗陶海牧場;山羊奶 廣東揭陽市揭西縣億豐牧場;牦牛奶 西藏羌塘牧場;駱駝奶 哈薩克食品直供基地;Tris、十二烷基硫酸鈉(SDS) 德國Sigma-Aldrich公司;PBS緩沖液(10×) 北京索萊寶公司;蔗糖、NaCl、MgCl2、Na2HPO4、EDTA、NH4Cl、乙醇 北京國藥控股化學試劑有限公司;丙酮、鹽酸 北京化工廠有限責任公司;KAPA PROBE FAST qPCR Kit試劑盒 美國KAPA Biosystems公司;核酸吸附柱 北京天根生化科技有限公司。

ABI 7500熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司;DK-S24恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;Nanodrop 2000分光光度計、Heraeus Multifuge X3離心機 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 實驗所需奶制品均為滅菌乳,分別從不同牧場購買和收集,包括牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶。另外,將牛奶和驢奶混合,制備5%、10%、30%、50%和80%的驢奶混合物作為標準樣品,以建立標準曲線。同時制備20%、50%、80%的驢奶混合物作為模擬摻假樣品。每個濃度的混合樣品進行三次重復。

1.2.2 DNA提取 對于市場上銷售的合格的滅菌乳,其體細胞數相對穩定,且乳制品的核酸大多存在于體細胞中,因此采用Pokorska法[20]從體細胞中提取DNA。取10 mL滅菌乳,4 ℃ 8500×g 離心15 min,去除乳脂和上清液。然后用2 mL緩沖液A(15 mmol/L Tris-HCl(pH7.4～7.6)、25 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、15 mmol/L Na2HPO4、2.5 mmol/L EDTA和1%蔗糖)洗滌含有奶制品體細胞的沉淀兩次。加入2 mL裂解液B(pH8.8;6% SDS、3 mmol/L MgCl2、15 mmol/L Tris-HCl、0.5% DMSO和6%丙酮),65 ℃孵育約2 h。隨后,加入450 μL的蛋白質沉淀緩沖液(2.35 mol/L NH4Cl,1.15 mol/L NaCl和38%乙醇),混合后,10 ℃ 16000×g離心8 min。將上層清液轉移到一個新的離心管,加入1000 μL 100%異丙醇,然后將混合物添加到核酸吸附柱中,13400×g離心1 min,使DNA吸附到硅膠膜上,再用70%的乙醇洗滌兩次,室溫干燥。最后,將純化的DNA用80 μL TE緩沖液溶解,并用Nanodrop 2000分光光度計檢測提取到的DNA的濃度,DNA的濃度為5～10 ng/μL,OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.1。

1.2.3 單拷貝核基因設計引物 以驢生長激素受體(the growth hormone receptor)為特異基因[16],以肌肉生長抑制基因(the muscle growth-inhibiting genes)為內參基因[21],設計特異性引物和內參引物。引物和探針的序列如表1所示,由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.4 熒光定量PCR反應 20 μL熒光定量PCR反應混合液包括:10 μL預混液(2×),0.4 μL正向引物,0.4 μL反向引物,0.4 μL探針,0.4 μL ROX(50×),2 μL DNA提取液和6.4 μL蒸餾水(ddH2O)。反應在ABI 7500儀器中進行,擴增步驟如下:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火32 s,反應進行50個循環;72 ℃延伸2 min。每個DNA模板重復PCR反應三次,ddH2O作為模板進行空白對照(NTC),監測污染。Ct值代表各反應中熒光強度達到特定閾值的循環數[22]。

1.2.5 特異性引物和通用性引物的驗證 分別使用特異性引物和內參引物在1.2.4中熒光定量PCR反應條件下同時擴增5個不同物種的乳制品的DNA樣本(牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶),對特異性引物和通用性引物進行驗證。NTC(No template control)為空白對照。

1.2.6 標準曲線的建立 將驢奶和牛奶進行混合,制備5%、10%、30%、50%和80%的驢奶摻假標準樣品,并按上述方法提取DNA進行擴增。并根據以下公式建立標準曲線:

Y=Ctspecific/Ctreference

Y=a X+b

其中:Ctspecific和Ctreference分別為驢的特異性引物和內參引物的Ct值,表示驢奶和總奶的DNA拷貝數[23],然后通過繪制Y與驢奶的含量(X=驢奶/總奶)之間的關系,創建校準曲線。

1.2.7 模擬摻假樣品分析 為了驗證該方法的實用性,分別以20%、50%和80%的比例將驢奶與牛奶混合,進行模擬摻假實驗。每個濃度在取樣時都做了三個平行。用得到的標準曲線計算驢奶在混合奶中的比例,與實際摻假比例進行對比,通過回收率、標準差(SD)和變異系數(CV)來驗證該方法的準確性。

1.2.8 市售驢奶樣品分析 由于目前市場上的驢奶產品以純驢奶為主,因此購買來自不同產地的驢奶,檢測其是否摻假及摻假比例,包括山東濟南、寧夏吳忠、河南駐馬店、新疆烏魯木齊。每個產地在取樣時做了三個平行,然后提取DNA,用特異性引物和通用引物以同一個DNA模板在不同反應體系中進行擴增,將得到的Ct值用標準曲線計算驢奶的含量,從而判定其是否摻假。

1.3 數據處理

使用Office軟件進行數據處理和圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 內參引物的驗證

為了驗證內參引物的通用性,用內參引物對不同物種的乳制品DNA進行了擴增(牛、山羊、牦牛、駱駝、驢),NTC作為空白對照。圖1顯示,所有物種的DNA均得到擴增,且Ct值分別為26.0367、30.5951、25.4488、28.9239和35.2356,而NTC在50個循環內沒有產生任何熒光信號,說明了內參引物的通用性。同時,也證明了所有這些物種的乳制品都可以提取DNA進行PCR擴增。

圖1 內參引物的熒光擴增曲線Fig.1 Fluorescent amplification curves of reference primer

圖2 驢特異性引物的熒光擴增曲線Fig.2 Fluorescent amplification curvesof donkey-specific primers

2.2 特異性引物的驗證

利用牛奶、山羊奶、牦牛奶、駱駝奶和驢奶的DNA進行熒光定量PCR反應,判斷基因的特異性。如圖2所示,僅驢奶的DNA得到了擴增,Ct值為35.1474,而其他無關物種的DNA在50個循環內沒有出現熒光信號。因此,該引物對目標物種具有較高的特異性。

2.3 標準曲線的建立

根據驢奶含量(驢奶/總奶)與Ct值(特異/內參基因)的線性關系,建立了一種標準化分析方法。由于內參基因可以在驢、牛等哺乳動物中恒定表達,無論采用何種DNA提取方法,由提取方法造成的DNA濃度的差異都能隨著內參基因的表達顯示不同的Ct值。而且,一般情況下,特異性基因和內參基因的PCR擴增效率會稍有差異,但通過以內參基因為對照的標準曲線可以消除不同的DNA提取方法、以及特異性基因和內參基因的PCR擴增效率產生的誤差。即以內參基因作為對照,根據不同百分比含量的驢奶所建立的標準曲線,能夠計算待檢樣品中驢奶的百分比含量,而非計算所含驢奶的具體毫升數。如圖3所示,當驢奶含量在5%～100%的范圍內,決定系數(R2)達到0.9650,標準曲線為y=-0.0023x+1.2288,表明了驢奶含量與Ct值之間具有良好的線性關系。該標準曲線不僅顯示了該方法的準確度較高,同時表明了在可疑樣品中可以檢測出5%～100%的驢奶含量。

表2 模擬摻假樣品的計算Table 2 Calculation of the simulated adulterated milk mixtures

圖3 驢奶含量定量的標準曲線Fig.3 Normalized calibration curve forthe quantitation of the donkey milk content

2.4 模擬摻假樣品分析

對含有20%、50%和80%的驢奶的模擬摻假樣品進行分析,通過提取DNA進行擴增,對得到的Ct值采用建立的標準曲線進行計算,將計算的驢奶含量與實際的驢奶含量進行對比。表2的結果顯示,模擬樣品的回收率為95%～120%,CV<10%,平均回收率為109.16%,平均CV值為4.68%,所有偏差結果均在10%的可接受范圍內[24],證實了該方法的準確性。

2.5 市售驢奶樣品分析

對購買的來自山東濟南、寧夏吳忠、河南駐馬店、新疆烏魯木齊的驢奶樣品進行分析。

表3 市售驢奶樣品的計算Table 3 Calculation of donkey milk samples for market

表3結果顯示,這些樣品中驢奶含量的計算結果均接近100%,表明目前市場上純驢奶的銷售具有一定的真實性。但鑒于這些驢奶的價格相對較高(約30～40元/250 mL),因此驢奶的品質也會相對有保證。

3 結論

驢奶業屬于“朝陽產業”,隨著其營養價值和藥用價值的逐漸開發,驢奶有望得到更廣泛的應用[25]。然而,目前市場上銷售的驢奶大多源于家庭作坊,且由于驢奶價格較為昂貴,存在一些不法商家為了牟取暴利而用價格較為低廉的牛奶對驢奶進行摻假的可能性。在>5%的摻假含量才能獲得經濟利益[17]的基礎上,需要建立一種能夠快速、靈敏地檢測驢奶含量的定量方法以確定其是否摻假及摻假比例。

本研究開發了一種標準化熒光定量PCR方法來定量檢測驢奶的含量。基于單拷貝核基因設計PCR引物,能夠控制因不同細胞中線粒體基因拷貝數不同帶來的誤差。同時,以內參基因為對照,基于驢奶含量與Ct值的標準曲線的建立能夠消除DNA提取率、PCR擴增效率導致的誤差。通過該標準曲線(R2=0.9650),能夠在5%～100%范圍內推斷驢奶的含量。最后,為了驗證方法的準確性,對含20%、50%和80%的驢奶的模擬摻假樣品進行分析,結果為平均回收率為109.16%,平均CV值為4.68%。綜上所述,這種熒光定量PCR方法能夠快速、靈敏地檢測混合奶制品中驢奶的含量,確定其是否摻假及摻假比例,為驢奶的市場監督提供了技術支持。