鯊魚單域抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的表達及熱穩定性分析

劉 鑫,屈躍寬,曹立民,隋建新

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種基于抗原抗體特異性結合的快速檢測技術,具有高靈敏性、簡便性和高通量等優點,被廣泛應用于農獸藥殘留、環境污染物、生物毒素和食品添加劑等危害物的檢測中。常規ELISA通常包括添加一抗和酶標二抗兩個關鍵環節[1],其中辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)標記的二抗是ELISA中的核心物質之一。現階段酶標二抗的制備普遍使用化學偶聯的方式將抗體與酶交聯,反應過程可能會產生分子的隨機交聯[2],導致酶活性及抗體親和性的不同程度損失。同時,化學偶聯物的分子比例難以控制,偶聯過程需要昂貴的試劑,且HRP標記的抗體對溫度敏感,在高溫下極易變性失活,這些不足影響了其在ELISA技術中的應用[3]。

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)可以水解去除底物上的磷酸基團,是廣泛使用的免疫診斷試劑之一,但其表面糖基含量較低,通過化學偶聯法獲得抗體-堿性磷酸酶復合物的效率較低,價格昂貴,熱穩定性較差[4],在ELISA中應用較少。研究報道發現,使用基因工程構建酶和抗體的融合蛋白可以代替化學偶聯的方法進行抗體標記[5-6],且可以克服化學偶聯方法的許多劣勢。針對單鏈抗體-堿性磷酸酶(scFv-AP)融合蛋白的研究表明,堿性磷酸酶可在保持酶活性的同時提高scFv-AP融合蛋白對抗原的親和力[7-8],在熒光免疫分析中具有更高的靈敏性[9]。近年來,雖然scFv-AP融合蛋白已用于萊克多巴胺、O,O-二乙基有機磷農藥[10-11]等小分子化合物的檢測,但通過基因工程技術獲得具有高親和力和高熱穩定性的單鏈抗體[12-13]仍然可遇不可求。

單域抗體(single-domain antibody,sdAbs)是利用基因工程技術從駱駝科動物和軟骨魚血清中克隆得到的只保留重鏈可變區的具有抗原結合活性的新型抗體[14]。與常規抗體相比,sdAb分子量小(約15 kDa),具有更高的親和力和熱穩定性。基于這些優點,包括駱駝重鏈可變區(VHH)和鯊魚重鏈可變區(VNAR)在內的sdAb已被廣泛用于治療、檢測和生物技術等領域[15-20]。研究發現,與原始VHH相比,VHH-AP融合蛋白可增加抗體的結合親和力,且熱穩定性與原始抗體相比沒有明顯變化[21-23]。鯊源VNAR因其特定的結構和生長環境而具有更好的親和力和穩定性[24-25],但受到動物養殖限制,關于VNAR的研究報道相對較少。

肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)作為絲氨酸蛋白酶的一種,廣泛存在于魚類肌肉組織中,在適宜條件下可有效降解肌原纖維中的肌球蛋白重鏈,是導致魚糜制品蛋白凝膠劣化、彈性下降的主要原因[26]。本實驗室前期利用鯊魚VNAR抗體進行了MBSP活性抑制的研究,該研究已通過噬菌體展示技術從鯊魚單域抗體文本庫中淘選出可識別MBSP的VNAR抗體基因,并表達出特異性識別MBSP的VNAR抗體,將其命名為B7(已申請名為“一種鰱魚魚糜凝膠劣化的生物抑制劑”的發明專利)。本研究以B7為目的基因,克隆表達單域抗體-堿性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,對融合蛋白的親和力和熱穩定性進行研究,可為單域抗體-堿性磷酸酶融合蛋白在ELISA中的應用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

限制性核酸內切酶和T4 DNA連接酶 北京New England Biolabs公司;2xT5 Super PCR Mix和DNA凝膠純化試劑盒 北京擎科生物技術有限公司;氨芐青霉素,SDS-PAGE凝膠試劑盒,異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和HRP標記羊抗鼠IgG 北京索萊寶科技有限公司;EL-P-NPP顯色試劑盒、引物AP-F和AP-R 上海生工生物工程股份有限公司;大腸桿菌DH5a感受態細胞,大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞和快速質粒小提試劑盒DP105 北京天根生化科技有限公司;生物素化試劑盒 江蘇博美達生物科學有限公司;所有緩沖液配制所用試劑 均為國產分析純;攜帶AP基因的載體pet22b-phoA 華南農業大學饋贈;鼠抗鯊魚VNAR抗體IgG 馬里蘭大學醫學院友情提供;兔源抗his標簽的多克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG 上海生工生物工程股份有限公司;MBSP蛋白、特異性VNAR抗體(B7)和堿性磷酸酶(AP) 本實驗室前期研究制備。

CMax Plus微孔板酶標儀 上海美谷分子儀器;Octet RED96e 美國加利福尼亞州ForteBio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒pet22b-B7-phoA的構建 通過互補限制位點將B7的C末端融合到堿性磷酸酶編碼基因片段phoA的N末端構建編碼B7-AP融合蛋白的重組質粒pet22b-B7-phoA。使用2xT5 Super PCR Mix,擴增B7基因(AP-F:5′-CAGAGCTCATAATAA GGAATTCCATGGCTCGAGTGGAC;AP-R:5′-AAGC TTGGCCGCATTCACAGTCAC)。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠驗證后用DNA凝膠純化試劑盒純化,用Sac I和Hind Ⅲ限制性核酸內切酶同時酶切目的片段B7和載體pet22b-phoA后,使用T4 DNA連接酶將酶切后的B7片段連接到載體pet22b-phoA中。通過熱擊法(42 ℃,45 s)將重組的pet22b-B7-phoA質粒轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中,將轉化的細菌接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,在37 ℃過夜培養后,挑選陽性單克隆按照快速質粒小提試劑盒DP105的使用方法提取質粒,送到上海生工生物工程股份有限公司進行DNA測序。

1.2.2 B7-AP融合蛋白的表達 以熱擊法將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板中37 ℃培養過夜。將培養物轉移到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液態培養基中37 ℃振蕩(轉速200 r/min)培養至OD600為0.4～0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,16 ℃振蕩(轉速200 r/min)誘導18 h,4000×g離心20 min收集細菌細胞,用TBS緩沖液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl)洗滌3次后復溶菌體,在高壓(6×107～7×107Pa)條件下破碎細胞。將破碎后的細胞用12000×g離心30 min后收集上清液,利用12% SDS-PAGE(按照北京索萊寶科技有限公司SDS-PAGE凝膠試劑盒的具體步驟配制)驗證[27]可溶性B7-AP融合蛋白的表達效果。

1.2.3 表達條件的優化 在1.2.2的基礎上,通過改變IPTG的終濃度(0～1 mmol/L,誘導溫度為16 ℃)和誘導溫度(16、20、30、37 ℃,IPTG終濃度為0.5 mmol/L)探究融合蛋白的最佳表達條件,并將表達后的上清液同樣通過12% SDS-PAGE進行驗證。

1.2.4 B7-AP融合蛋白的純化 將表達上清液經0.45 μm無菌過濾器除菌后上樣到Ni-親和層析柱中,用十倍柱床體積的結合緩沖液(TBS緩沖液,pH8.0)洗滌后,用含不同濃度(20、50、100、200 mmol/L)咪唑的結合緩沖液洗脫,收集各洗脫組分,利用12% SDS-PAGE 驗證純化效果,使用Image J軟件調節凝膠圖片的灰度,對洗脫后的蛋白質條帶進行灰度分析,確定純化后融合蛋白的純度。并利用兔源抗his標簽的多克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG進行Western blot(WB)鑒定,最后收集純化的B7-AP融合蛋白,用TBS緩沖液于4 ℃過夜透析后在-20 ℃條件下存儲備用。

1.2.5 B7-AP融合蛋白的鑒定

1.2.5.1 B7-AP融合蛋白的酶活測定 將B7-AP融合蛋白和AP分別稀釋成系列濃度后添加到96孔板中,100 μL/孔,再向孔中添加100 μL P-NPP試劑,混勻后置于37 ℃下孵育5 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液終止反應,利用CMax Plus微孔板酶標儀測定405 nm處的吸光度。

1.2.5.2 B7-AP融合蛋白的抗體親和力測定 鯊魚VNAR抗體B7對MBSP的特異性在本實驗室的前期研究中已經證實,考慮融合蛋白的表達沒有改變B7的基因序列,因此在本研究中采用生物膜干涉技術(Biofilm interference,BLI)測定融合蛋白與MBSP的特異性親和能力。具體操作為:用PBS緩沖液平衡傳感器60 s后,加入生物素標記后的MBSP(濃度為5 μg/mL)進行固定,用PBST緩沖液(含0.02% Tween-20的PBS緩沖液,pH7.4)封閉180 s。在30 ℃的恒溫條件下觀察不同梯度下B7-AP融合蛋白及特異性VNAR抗體B7與MBSP的結合和解離情況,并通過Octet RED96e數據處理程序計算B7-AP融合蛋白和特異性VNAR抗體B7的親和常數(KD)。

1.2.6 B7-AP融合蛋白的熱穩定性分析 熱處理可能會影響融合蛋白中AP的催化活性和B7的抗原結合活性,本研究將融合蛋白和單獨的B7、AP在不同溫度(20～85 ℃)和時間(0～180 min)下加熱處理后,分別進行活性對比。

1.2.6.1 融合蛋白B7-AP和AP酶活測定 方法同1.2.5。

1.2.6.2 抗原結合能力測定 B7抗原結合能力測定方法采用常規間接ELISA方法,MBSP包被濃度為 30 μg/mL,一抗為特異性VNAR抗體B7,二抗為鼠抗鯊魚VNAR抗體IgG,最后加入HRP標記的羊抗鼠IgG用于顯色;B7-AP融合蛋白的抗原結合能力采用直接ELISA方法測定:將MBSP用CBS緩沖液稀釋至30 μg/mL后添加到96孔板(100 μL/孔)中,37 ℃孵育2 h后用TBST緩沖液(含有0.05%的Tween-20,pH7.4的TBS緩沖液)洗滌3次。每孔添加300 μL含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液,在4 ℃條件下過夜封閉,并用TBST緩沖液洗滌3次。加入經過不同熱處理并恢復至室溫的B7-AP融合蛋白稀釋液,在37 ℃孵育1.5 h后,用TBST緩沖液洗滌3次,加入100 μL稀釋的P-NPP試劑并在37 ℃下孵育15 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液終止反應,使用CMax Plus微孔板酶標儀測定405 nm處的吸光度。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次,應用Origin 8.5數據分析軟件進行數據的誤差分析及作圖。

2 結果與討論

2.1 B7-AP融合蛋白的表達

B7-AP融合蛋白由sdAb(14.3 kDa)和AP(47.7 kDa)兩部分組成,理論分子量為62 kDa。如圖1a所示,誘導溫度對B7-AP融合蛋白的表達影響顯著,僅在較低的誘導溫度(16 ℃/20 ℃)下上清液中才出現目標條帶,在30和37 ℃時上清液中并無目的蛋白的表達。這可能是由于在誘導溫度較高時,轉錄和翻譯速度過快,多肽鏈沒有足夠時間進行正確折疊,二硫鍵以錯誤形式形成,蛋白質易形成錯誤的空間結構,進而形成無蛋白活性的包涵體,而在較低溫度時,基因的翻譯速率變慢,有利于蛋白質的正確折疊,促進蛋白的可溶性表達[28-29]。IPTG濃度在0.05～1 mmol/L范圍內對B7-AP融合蛋白的表達無明顯影響(圖1b,圖1c),考慮到IPTG的存在可能會抑制細菌的生長,選擇0.05 mmol/L的IPTG作為最終誘導濃度。

圖1 表達條件優化的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE gel image ofthe optimization of expression conditions注:a圖表示不同溫度下誘導表達的B7-AP融合蛋白;b圖表示不同IPTG濃度(0～0.2 mmol/L)誘導的B7-AP融合蛋白;c圖表示不同IPTG濃度(0～1 mmol/L)誘導的B7-AP融合蛋白。

用Ni-親和層析純化的B7-AP融合蛋白,通過SDS-PAGE和WB均發現一個約63 kDa的目的條帶(圖2),表明B7-AP融合蛋白表達成功。經計算,1 L發酵液可以純化得到5 mg純度為 90%的B7-AP融合蛋白。

圖2 純化后B7-AP融合蛋白的SDS-PAGE圖和Western Blot圖Fig.2 SDS-PAGE and WesternBlot gel image of purified B7-AP注:泳道M為標準蛋白;泳道1為空白對照組;泳道2為表達后的上清提取液;泳道3為純化后的B7-AP融合蛋白;泳道4為純化后B7-AP融合蛋白的Western Blot圖。

2.2 B7-AP融合蛋白的活性

B7-AP融合蛋白應同時具有酶促活性和抗原結合活性。EL-P-NPP顯色試劑盒檢測表明:B7-AP融合蛋白表現出良好的顯色反應,在405 nm處的吸光度隨融合蛋白濃度的增加而增加,在1.25 μmol/L的濃度下吸光度達到4.00(圖3)。在相同摩爾濃度下,B7-AP融合蛋白的OD405值略低于AP,這可能是因為酶的活性取決于其結合基團、催化基團及其酶活性中心的空間結構,融合蛋白的空間折疊覆蓋了部分堿性磷酸酶的活性位點,并使其空間結構發生改變[30]。

圖3 在相同摩爾濃度下B7-AP融合蛋白與AP的酶活性對比Fig.3 The enzyme activity of the B7-AP fusionprotein compared with AP at the same molar concentration

BLI是一種無標記的生物分析技術,通過測量親和常數(KD,單位為mol/L),結合常數(Kon,即在1 mol/L的反應物A和B下,每秒產生的復合物數量,單位為L/(mol·s))和解離常數(Koff,即每秒解離的復合物的百分比,單位為1/s)等動力學參數,直接分析抗體對抗原的特異性識別效果。Kon表示抗原抗體形成復合物的形成速率,Kon值越大,抗原抗體結合越快;Koff反映了形成的復合物的穩定性,Koff值越大,復合物解離越快;KD則可以反映抗原與抗體相互作用的結合能力的大小,當KD值達到10-8mol/L時,表明抗原抗體之間具有很高的親和性。結果顯示(圖4,表1):抗原抗體的結合程度隨抗體濃度的增加而增加,融合蛋白B7-AP比B7具有更高的Kon值和更低的Koff值,表明融合蛋白更容易結合抗原并產生更穩定的綴合物。同時,B7-AP的KD(Koff/Kon)值(7.80×10-8mol/L)低于B7的KD值(1.94×10-7mol/L),表明融合蛋白的親和力優于B7。已有研究發現,AP在溶液中可以自發產生二聚體,增強融合抗體的活性,進而增強抗體與抗原的有效結合[5,31],本實驗也表明,B7-AP融合的二聚化顯然有助于抗體具有更高的抗原結合力。

圖4 不同濃度抗體的結合解離曲線Fig.4 The binding and dissociation curves ofantibodies at different concentrations注:a圖為不同濃度B7的結合解離圖;b圖為不同濃度B7-AP的結合解離圖。

表1 B7和B7-AP的Kon,Koff和KD值Table 1 Comparison of Kon,Koff andKD value between B7 and B7-AP

2.3 融合蛋白的熱穩定性

圖5 B7-AP融合蛋白的熱穩定性測量結果Fig.5 The thermal stability measurement of the B7-AP fusion protein注:a圖為不同溫度下處理10 min后保留酶活對比結果;b圖為58 ℃下處理不同時間后保留酶活對比結果;c圖為不同溫度下處理10 min后保留的抗原結合能力對比結果;d圖為58 ℃下處理不同時間后保留的抗原結合能力對比結果。

在不同溫度下處理10 min后,單獨的AP活性呈現先升高后降低的趨勢,在37～70 ℃溫度范圍內活性較高,在85 ℃加熱10 min后,仍保留了80%以上的活性,表明AP二聚體的形成可能增強AP對熱的抵抗力[32],而融合蛋白的AP活性在58 ℃處理10 min后即喪失了超過30%(圖5a);雖然在加熱10 min后融合蛋白不如單獨的AP酶活高,但在58 ℃加熱180 min后,單獨AP的活性損失了80%以上,而融合蛋白的酶活卻可以保留60%以上(圖5b)。這可能是因為當融合蛋白中的兩個蛋白分子相互作用時,促進了接觸表面上水分子的排出,從而降低了自由能,使蛋白更加折疊并增強了融合蛋白的穩定性[33]。

在不同溫度下處理10 min后,單獨B7的結合活性保持良好,85 ℃加熱10 min后結合活性甚至達到未加熱前的三倍,這種現象的產生可能與單域抗體的特殊結構有關,短時間加熱使單域抗體的結構充分伸展,快速冷卻后,單域抗體進行重折疊并形成了更利于與抗原結合的結構[34]。融合蛋白的抗原結合活性呈現先增加后下降的趨勢,在58 ℃時結合活性達到最大值,在85 ℃時可保留50%的活性(圖5c),由于B7-AP融合蛋白在85 ℃處理10 min后僅保留20%的酶活性(圖5a),因此不難推測,加熱處理后B7-AP融合蛋白對MBSP的抗原結合能力是顯著升高的,結果所顯示的活性降低主要受融合蛋白中AP熱變性的影響[23]。更重要的是,即使在58 ℃下處理180 min,B7-AP融合蛋白的整體活性仍幾乎沒有變化(圖5d),體現出比傳統酶標抗體更好的熱穩定性和應用潛力。

3 結論

本研究表達并純化出針對MBSP的單域抗體—堿性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,并對融合蛋白的性能和熱穩定性進行了評價,為單域抗體在免疫分析中的應用提供了參考。結果表明,以0.05 mmol/L IPTG為誘導劑,在16 ℃條件下融合蛋白可以實現可溶性表達,Ni親和純化后蛋白純度可以達到90%以上,產量為5 mg/L;融合蛋白對MBSP具有高親和力,且熱穩定性極佳,可以作為一種潛在的免疫診斷劑應用于ELISA的檢測過程中。