茶枝柑果肉發酵過程中感官特性及抗氧化活性的變化

周 林,胡金梅,洪峻峰,黃志楓

(1.廣東藥科大學,廣東廣州 510006; 2.廣東環境保護工程職業學院,廣東佛山 528216)

茶枝柑(Citrusreticulata‘chachi’)別名大紅柑、新會柑,是廣東新會的傳統栽培柑橘品種,已有700多年的栽培歷史[1]。以新會茶枝柑加工的新會陳皮在2006年獲批中國地理標志產品,2018年行業產值達到60億元。由于未成熟的茶枝柑果肉口感青澀,榨汁后會釋放檸檬苦素等物質,使果汁里帶有苦澀的口感而難以食用[2-3],因此制作陳皮后的果肉被大量廢棄,浪費資源的同時還產生一定的環境問題。而茶枝柑果肉富含糖類、有機酸、維生素、膳食纖維、黃酮、多酚等生物活性物質[4],應該得到更好的利用。

表1 CFJ感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of CFJ

研究人員已經開展了茶枝柑果酒[2]、果醋[3]的加工工藝研究。近年來以果汁、蔬菜汁為主要原料,經乳酸菌或酵母菌單獨或混合發酵制成的發酵食品、發酵果蔬汁越來越受到消費者的青睞[5],也為茶枝柑果肉的加工利用提供了新的契機。研究發現,通過益生菌發酵可以保持或改善果蔬的營養及感官特性[6-7];相比于蘋果汁、菠蘿汁、杏汁和葡萄汁,柑橘汁表現出更強的抗氧化活性[8]。而經過酵母菌20 ℃ 15 d發酵的柑橘汁,類胡蘿卜素和黃酮含量增加,抗氧化活性增強[9]。在確保果蔬營養的同時,改善口感欠佳的果蔬風味,縮短發酵時間,成為開發具有市場競爭力的茶枝柑果肉發酵方法的關鍵。因而,高效的茶枝柑果肉發酵方法的建立,不僅有利于解決茶枝柑果肉廢棄產生的環境污染問題,也為當地農民增收開辟一條新途徑,具有良好的社會意義和潛在的商業價值。

本實驗以茶枝柑果肉為原料,經酵母菌發酵后制備成一種新型的茶枝柑發酵果汁(fermenting juice of chachi,CFJ),研究其發酵過程中的感官特性、香氣成分、總酸、還原糖、總酚、總黃酮等營養成分以及抗氧化活性,以期揭示CFJ發酵過程中風味口感、營養成分和抗氧化活性的變化,為新會茶枝柑果肉及相關產品的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶枝柑 8月份采摘的制作陳皮用青柑,廣東新會江門麗宮國際食品有限公司惠贈;酵母菌種 市售安琪高活性干酵母粉。葡萄糖 食品級,廣州市琪福食品有限公司;3,5-二硝基水楊酸、福林酚 上海麥克林生化科技有限公司;亞硫酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、酚酞、碳酸鈉、乙醇、甲醇、硫酸亞鐵 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司;沒食子酸標準品、蘆丁標準品(純度均≥98%) 南京源植生物科技有限公司;鄰菲羅啉 分析純,廣州化學試劑廠;pH7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)(干粉) 北京酷來搏科技有限公司;過氧化氫 分析純,天津市百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH) 福州飛凈生物科技有限公司;一次性無菌注射器 湖南平安醫械科技有限公司;0.45 μm微孔過濾膜 天津市科億隆實驗設備有限公司。

WJE-L榨汁機 浙江寧波沃瑪電器有限公司;PA-12C酸奶機 中山市領銳電器有限公司;JJ-2000B電子天平 美國雙杰兄弟(集團)有限公司;HHS-2S恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;SC-06離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;UV-5500PC紫外分光光度計 廣州市深華生物技術有限公司;7890B GC-MS液相色譜-質譜聯用儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CFJ的制備 挑選完整無損傷的茶枝柑,蒸餾水清洗干凈后去皮,用榨汁機對果肉進行榨汁,然后將果汁轉移到酸奶機中,加入40%葡萄糖以及0.5%的酵母菌種,40 ℃發酵96 h。根據產品說明書,該酵母可以耐受40～42 ℃高溫。每隔24 h對發酵果汁進行攪拌,同時取樣置于離心管中,10000 r/min離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜后-20 ℃保存備用。

1.2.2 CFJ的感官評價 每隔24 h取出適量的茶枝柑發酵果汁,由6人組成的評價小組對色澤、組織狀態、酸味、甜味、苦澀、香氣進行感官評價[10-11],其中4名男性,2名女性,同一批樣品取樣后隨機提供給感官評價人員。評分標準見表1。

1.2.3 CFJ主要活性成分的測定

1.2.3.1 還原糖含量的測定 通過DNS法測定茶枝柑發酵果汁中還原糖含量[12]。標準曲線為y=1.3166x-0.0340,R2=0.993,x為葡萄糖濃度(mg/mL)。

1.2.3.2 總酸含量的測定 參考國標GB/T 12456-2008的酸堿滴定法[13]。

1.2.3.3 總酚含量的測定 參考Surveswaran等[14]的方法以沒食子酸為標準品,通過加入福林酚和碳酸鈉溶液顯色后進行OD760分光光度法測定和計算。標準曲線為y=1.1010x+0.0420,R2=0.995,x為沒食子酸濃度(mg/mL)。

表2 CFJ感官評價結果Table 2 Sensory evaluation of CFJ

1.2.3.4 總黃酮含量的測定 參考Kim等[15]的方法,以蘆丁標準品和30%的乙醇配制成濃度為0.2 mg/mL蘆丁標準溶液。測定體系為:0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液,加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液,混勻靜置6 min;加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻;最后加入2.4 mL 30%乙醇,混勻后暗處靜置10 min,于510 nm處采用分光光度法測定和計算。標準曲線為y=11.2570x-0.0081,R2=0.999,x為蘆丁濃度(mg/mL)。

1.2.3.5 GC-MS測定香氣成分的含量 取出凍存的果汁樣品,在30 ℃的水浴中迅速解凍,精確量取果汁5 mL放入5 mL的飽和NaCl水溶液中,置于20 mL螺口頂空瓶中,用聚四氟乙烯隔墊密封瓶蓋旋緊后混勻,上機檢測。萃取針頭:DVB/CAR/PDMS(50/30 μm),40 ℃平衡5 min,頂空吸附40 min,解析3 min。色譜條件:使用Rxi-lms毛細管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升溫程序為:初始溫度34 ℃,以5 ℃/min的速度升至100 ℃,再以3 ℃/min的速度升至110 ℃,最后以10 ℃/min的速度升至230 ℃,保持2 min。載氣He(純度大于99.999%),不分流,流速1.38 mL/min。進樣口溫度250 ℃,傳輸線溫度為250 ℃。

質譜條件:離子源溫度設為200 ℃,電離方式為EI,電子能量設為70 eV,掃描范圍為35～500 m/z。

定性采用各組分在圖譜庫NIST(依據檢測處的圖譜庫)進行匹配,采用匹配程度大于80%的鑒定結果,并與文獻資料[16-17]分析結果進行比對分析,峰面積歸一法計算揮發性物質的相對百分含量。

1.2.4 CFJ抗氧化活性的測定

1.2.4.1 ·OH清除率測定 參考文獻分光光度法測定[18]:測定體系為0.5 mL鄰菲羅啉溶液和1.0 mL 濃度為0.75 mol/L,pH7.4的PBS緩沖液;加入0.5 mL待測樣品和0.5 mL 0.01% H2O2,振蕩搖勻,37 ℃水浴60 min,在536 nm處測定吸光值A2。以等體積水代替H2O2溶液,測定吸光值A1,以扣除樣品本身顏色干擾;以等體積水代替樣品,為空白樣,測定吸光值A0,每份樣品平行測定3次,取平均值。按式(1)計算樣品·OH的清除率:

式(1)

1.2.4.2 DPPH·清除率測定 參考文獻[19]分光光度法測定:測定體系為2 mL 0.180 mmol/L DPPH溶液和0.065 mL樣品,振蕩搖勻,室溫放置30 min,測定514 nm處的吸光度值A2,用等體積的無水甲醇代替DPPH溶液,測定吸光值A1,以扣除樣品本身顏色干擾;以等體積無水甲醇代替樣品,為空白樣,測定吸光值A0,每份樣品平行測定3次,取平均值。按式(2)計算樣品DPPH·的清除率:

式(2)

1.3 數據處理

除GC-MS數據外,每組實驗重復3次,實驗結果以均數±標準差(Mean±SD)表示,應用統計學軟件SPSS 21.0對實驗數據進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 CFJ感官評價

如表2和圖1所示,CFJ發酵前后的感官特性變化主要表現在:直接提取的茶質柑果汁口感酸澀,難以入口,添加了40%葡萄糖后,甜味明顯增加,但是苦澀感強;發酵后的CFJ口感酸甜適中,苦澀感較弱。發酵前的CFJ果香味較濃;發酵后的CFJ發酵風味較濃而果香味較淡。發酵前的CFJ質地均勻,無沉淀;發酵后的CFJ有少量沉淀。CFJ發酵前后口感的變化需要結合后續的理化指標進行分析。

圖1 CFJ感官評價雷達圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of CFJ

2.2 CFJ發酵過程主要活性成分含量變化

如圖2a所示,從0～96 h隨著發酵的進行,CFJ中的還原糖被菌體利用而減少,其中在發酵0～24 h期間,還原糖含量下降幅度最大,減少了14.1%,可能是因為酵母菌種處于對數生長期,碳源迅速消耗。同時,總酸含量逐漸下降,然后趨于穩定,檸檬酸和蘋果酸是各種柑橘中主要的酸類物質[20],在兼性厭氧或厭氧條件下被酵母菌分解,生成乙醇和CO2,從而導致總酸含量的下降,在其它果汁發酵過程中總酸含量也表現出相似的變化趨勢[21]。

表3 CFJ發酵過程中揮發性成分和相對含量Table 3 Volatile extracts and their relative contents in fermentation process of CFJ

圖2 CFJ發酵過程中總酸、還原糖、總酚、總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of the total acid,reducing sugar,total phenolicand total flavonoid contents in fermentation process of CFJ注:a:總酸和還原糖;b:總酚和總黃酮。

發酵0～48 h,總酚和總黃酮含量亦呈下降趨勢(圖2b),與陳亞楠等[22]用乳酸菌發酵陳皮柑飲料的結果相似,可能是酚類物質自身容易氧化分解導致含量下降。48～96 h,總酚和黃酮含量略有增加,可能是隨著發酵的進行,乙醇和CO2的含量增加,有利于茶枝柑果汁中的酚類物質被浸出,導致其含量的增加。

2.3 GC-MS測定香氣成分的含量的結果

通過GC-MS檢測CFJ發酵過程中產生的揮發性成分及其相對含量(表3),可知0～96 h發酵過程中,烯烴的相對含量最高,從53.70%增加至77.77%,主要成分為d-檸檬烯和γ-萜烯。其中d-檸檬烯在所有香氣成分中含量最高,和文獻[17]的報道一致。d-檸檬烯和γ-萜烯是同分異構體,分子式為C10H16,也是柑橘類水果中的天然成分和橙皮精油中的主要成分,分別呈新鮮橙子和檸檬香氣[23]。其次是醇類,由34.50%降至16.05%,主要成分為α-松油醇和4-萜烯醇;α-松油醇和4-萜烯醇也是同分異構體,分子式為C10H18O,分別呈丁香味[24]、辛香和木香味[25]。酯類由7.74%降至2.14%,主要成分為2-(甲氨基)苯甲酸甲酯,周欣等[26]報道2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作為新會陳皮含有的特定揮發性成分,可用于新會陳皮的鑒定。因此在果肉發酵液中也檢測出了該成分。醛酮、酚類的相對含量均較低(<1%)。

綜合上述結果,0～96 h發酵過程中上述烯烴成分增加,而醇類和酯類成分減少,這和茶枝柑果肉發酵后果香味有所保留,但是整體仍然減輕的感官評價是一致的。另外,發酵24 h以后香茅醇后沒有檢出,而香茅醇具有一定的苦味[27],可以推測感官評價中果汁經過發酵后,苦澀感降低可能與之存在一定的關聯。這些揮發性物質種類和含量的變化有助于理解感官分析的結果,但是這些成分變化和感官變化之間的關系還需要深入研究,尤其是發酵后果汁液體組分中檸檬苦素、檸檬酸、蘋果酸等含量的變化規律,需要結合對應的標準物質進行精確的定性和定量。

表4 主要化學成分與兩種自由基清除率的相關性分析Table 4 Correlation analysis between main chemical components and scavenging rate of two free radicals

2.4 CFJ發酵過程抗氧化活性變化

CFJ發酵過程中體外抗氧化活性的測試結果見圖3。發酵前含果肉的果汁混合液·OH和DPPH·清除率均為最大值,分別為85.57%和84.40%。發酵0～24 h兩種自由基清除率有所下降,其中·OH清除率下降13.24%,DPPH·清除率下降26.98%,說明發酵后CFJ中抗氧化成分的含量減少。發酵48～96 h兩種自由基清除率基本趨于平穩,說明茶枝柑果汁的部分活性物質和抗氧化性能在一定程度上達到穩定。已有陳皮提取物抗氧化活性與多酚含量呈正相關的報道[28],這和本研究中0～24 h CFJ抗氧化活性降低和黃酮、多酚類物質含量減少的實驗結果是一致的。

圖3 CFJ對·OH和DPPH·清除率的變化Fig.3 Changes of scavenging rateagainst ·OH and DPPH·by CFJ

2.5 主要活性成分與抗氧化活性能力相關性分析

利用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行相關性分析(表4),可見DPPH·清除率與·OH清除率、總酚含量、總黃酮含量、總酸含量和還原糖含量均呈顯著正相關(P<0.05),說明總酚含量、總黃酮含量、總酸含量和還原糖含量對DPPH·的清除有顯著的影響。·OH清除率與總酸含量呈極顯著相關(P<0.01);與總黃酮含量和還原糖含量均呈顯著相關(P<0.05);與總酚含量無顯著的相關性(P=0.075)。說明總酸含量對·OH的清除有極顯著的影響,總黃酮含量和還原糖含量對·OH的清除有顯著的影響,總酚含量對·OH的清除無顯著的影響。綜合上述結果說明,與·OH清除率相比較,DPPH·清除率可以更好地用于該發酵過程中總酚、總黃酮抗氧化活性的檢測。

上述結果也可以說明,茶枝柑果汁中的活性成分含量決定果汁的抗氧化活性能力,但抗氧化活性能力的強弱并不是由單一的某種活性成分所決定的,而是各種抗氧化活性成分協同作用的結果。相關的報道有:Sicari等[29]研究了15種柑橘,發現酚類物質在柑橘水果總抗氧化能力占主導地位,黃酮類化合物具有重要的清除自由基的能力;Park等[30]采用乳酸菌發酵混合漿果汁后,其抗氧化活性呈現上升的趨勢;Mousavi等[31]利用乳酸菌發酵石榴汁,發現花青素含量均顯著降低,抗氧化活性呈現下降趨勢。還有研究報道,采用混菌發酵方式,能增加發酵果汁中的黃酮、多酚含量,并提高其抗氧化能力[32-33]。因此,不同的實驗研究得到的結果表現出一定的差異,這與實驗材料、微生物菌種、處理方法和發酵條件等有關。需要說明的是,大多數果肉、果渣或果汁采用酵母菌發酵時溫度為20～28 ℃,本實驗中采用了耐高溫的安琪酵母,主要是考慮到大規模發酵時相對較高的溫度有利于降低發酵過程降溫消耗的能源成本,表明在40 ℃進行的發酵達到了預期的目標。由于發酵溫度不僅影響發酵終點到達的時間,還會影響菌體的氧化應激、代謝產物的類型[34],因而溫度對茶枝柑果肉發酵過程的具體影響還有待深入。

3 結論

以茶枝柑果肉為原料,經安琪酵母40 ℃發酵96 h后制備成一種茶枝柑發酵果汁。在感官評價方面,茶枝柑發酵果汁口感酸甜適中,苦澀感較弱,帶有淡淡的果香和濃郁的發酵風味,與酸澀的茶枝柑果肉相比在風味口感上有很大的改善。對揮發性香味物質的GS-MS分析表明,發酵后揮發性香氣物質相對含量最高的為烯烴,由53.70%增加至77.77%;而醇類、酯類則有所降低,分別由34.50%降至16.05%,7.74%降至2.44%;醛酮類、酚類的含量均低于1%。發酵風味的改善與發酵過程中主要化學成分的改變有關。在體外抗氧化活性評價方面,茶枝柑發酵果汁對·OH和DPPH·的清除率有所下降,抗氧化活性能力有所降低,這與茶枝柑發酵果汁中多酚、黃酮等成分含量的下降有關。研究初步揭示了茶枝柑果肉發酵過程中風味成分和抗氧化活性變化的規律,為茶枝柑果肉飲料的開發提供了依據。