響應面法優化面包果淀粉的酶法提取工藝

鐘雪瑤,王少曼,+,張彥軍,*,徐 飛,譚樂和,*,于寒松,吳 剛

(1.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所,海南萬寧 571533; 2.吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130000)

面包果(Artocarpusaltilis)屬桑科熱帶木本糧食作物,原產于太平洋群島及印度、菲律賓[1],目前主要在我國海南、廣東等引種栽培[2]。面包果樹每株每季度果實產量可達50～200個[3],是一些熱帶發展中國家的重要糧食作物資源[4],富含淀粉(12.76%)、膳食纖維(5.19%)、蛋白質(0.95%)和多種人體必需礦物質[5]。面包果鮮果采收1～3 d內會迅速軟化,儲存性能差[6],而將面包果加工成淀粉可便于存儲和增加通用性。

目前淀粉提取的主要方法有濕磨法、堿法、酶法和超聲波法[7]。Estrada-León等[8]采用濕磨法提取象耳豆淀粉但其提取率較低;陳子月等[9]表明與酶法相比,堿法制備大米淀粉的溶解度對溫度更敏感,而堿法提取會產生大量堿液造成環境污染;Wang等[10]表明酶法和超聲波法相結合能顯著提高大米淀粉的提取率,但提取的淀粉易破損,導致淀粉性質發生改變。與其他提取方法相比,酶法提取具有溫和、破損率低、污染小、效率高等優點[11]。目前對面包果的研究主要集中在面包果淀粉的加工利用方面[12-13],Nwabueze等[14]采用響應面法優化面包果加工膨化食品的工藝條件;Betiku等[15]通過響應面法優化面包果淀粉水解產物以生產乙醇的工藝參數,而關于面包果淀粉酶法制備工藝的優化尚未見報道。

本課題前期實驗發現采用中性蛋白酶法提取面包果淀粉提取率高且破損率低,因此采用單因素實驗探究中性蛋白酶法提取面包果淀粉的工藝條件,并通過響應面法優化確定淀粉提取的最佳工藝參數,為建立科學高效的面包果淀粉提取工藝提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

面包果 中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供;中性蛋白酶Protex-7L(酶活200000 U/g) Novozyme公司;其他試劑 均為國產分析純。

AL104型電子天平 美國梅特勒-托利多儀器有限公司;HX-PB908多功能料理機 奧克斯集團有限公司;Master-s-plus UVF型全自動超純水系統 上海和泰;Avanti JXN-26型高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿有限公司;JDG-0.2真空冷凍干燥機 蘭州科技真空凍干技術有限公司;RH-600A高速多功能粉碎機 榮浩五金廠;盛藍HZ-2010 K多層恒溫搖床 常州市三盛儀器制造有限公司;MB45型快速水分測定儀 美國梅特勒-托利多儀器有限公司;NDA701杜馬斯定氮儀 意大利VELP;DHG-9625 A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;DLSB-5 L/10低溫冷卻循環泵 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 面包果淀粉的提取 新鮮面包果→去皮→切塊→清洗→研磨→酶解→過濾→水洗→離心→凍干→成品。

將新鮮的面包果去皮切塊之后清洗干凈,按一定的料液比例加入蒸餾水,置于多功能料理機中磨漿20 s,將面包果磨漿液與一定量的中性蛋白酶液混合,分裝于錐形瓶中,置于設定到一定溫度的搖床上進行酶解,反應結束后用100目網篩過濾,濾渣再水洗過濾三次,收集合并濾漿,室溫靜置2 h,棄去上清液,絮狀物經蒸餾水洗滌表面后離心(8000 r/min,15 min),輕輕刮去沉淀物上層淡黃色物質,沉淀物反復水洗離心兩次,收集沉淀物在冰箱(-20 ℃)中冷凍12 h,再真空干燥(55 ℃)12 h[16]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 料液比對面包果淀粉提取率的影響 在酶解溫度60 ℃、酶解時間6 h、加酶量0.125%(占原料和水總質量百分比)的條件下,考察料液比(原料質量與蒸餾水體積比)分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL時對面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的料液比。

1.2.2.2 酶解溫度對面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解時間6 h、加酶量0.125%的條件下,分別取酶解溫度40、50、60、70、80 ℃,探究不同酶解溫度對面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶解溫度。

1.2.2.3 酶解時間對面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解溫度60 ℃、加酶量0.125%的條件下,分別取酶解時間2、4、6、8、10 h,探究不同酶解時間對面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶解時間。

1.2.2.4 加酶量對面包果淀粉提取率的影響 在料液比1∶4 g/mL、酶解溫度60 ℃、酶解時間6 h的條件下,考察加酶量分別為0.05%、0.075%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%對面包果淀粉提取率的影響,從而確定最佳的酶添加量。

1.2.3 響應面試驗 根據Box-Behnken組合實驗設計原理,在單因素實驗結果的基礎上,選擇料液比、酶解溫度、酶解時間和加酶量作為研究因素,并以面包果淀粉提取率為響應值,進行四因素三水平的響應面設計與分析,試驗因素及水平設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 面包果中淀粉含量的測定 依據GB 5009.9-2016采用第二法測定[17]。鮮面包果中淀粉含量為0.1259 g/g。

1.2.5 面包果淀粉提取率的測定

式中:W1表示每克面包果提取得到的淀粉質量(干基),g;W2表示每克面包果中淀粉含量(干基),g。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行差異性顯著分析,其中P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;采用Origin 2018軟件繪圖,數據以“平均值±標準差”顯示;采用Design-Expert 8.0軟件進行響應面實驗設計與分析。所有數據均為三次實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對面包果淀粉提取率的影響 料液比對面包果淀粉提取率的影響如圖1所示。由圖1可見,隨著料液比中蒸餾水量的增加,面包果淀粉提取率先呈現顯著上升趨勢(P<0.05),在料液比1∶4時達到最高(62.21%),繼續增加水量,提取率則呈下降趨勢。料液比為1∶2時,淀粉溶液較黏稠,流動性差,酶與底物蛋白接觸不充分,不利于酶促反應的發生,而降低了面包果淀粉分子的釋放[18]。隨著料液比的增加,有更多的溶劑滲透到物料中,增大了面包果淀粉與水的接觸面積,進而中性蛋白酶與底物蛋白充分接觸反應,使面包果淀粉分子最大限度游離出來。當料液比大于1∶4時,面包果淀粉提取率下降,可能是由于料液中酶濃度被稀釋,酶促反應不徹底[19]。綜上所述,選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5進行響應面優化試驗。

圖1 料液比對面包果淀粉提取率的影響Fig.1 Effects of solid/liquid ratio on theextraction rate of breadfruit starch注:不同字母表示不同提取條件間差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 酶解溫度對面包果淀粉提取率的影響 不同酶解溫度對面包果淀粉提取率的影響見圖2。由圖2可見,隨著酶解溫度的升高,面包果淀粉提取率先增加后減小,在酶解溫度為60 ℃時,面包果提取率呈現最大值,為61.18%。導致這種趨勢的原因主要是在一定的溫度范圍內,隨著溫度的升高,活化分子數增加,分子間的碰撞機率增加,從而增強中性蛋白酶酶促反應速率[20]。當酶解溫度超過中性蛋白酶的活性承受范圍,會引起中性蛋白酶變性甚至失活,結果導致酶促反應的減緩甚至停止,從而降低面包果淀粉的提取率。此外,過高的溫度引起淀粉糊化,溶液粘稠度增加而進一步影響蛋白酶作用效果[21]。故選用50、60、70 ℃作為響應面優化試驗的水平。

圖2 酶解溫度對面包果淀粉提取率的影響Fig.2 Effects of enzymolysis temperatureon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.3 酶解時間對面包果淀粉提取率的影響 面包果淀粉提取率隨酶解時間變化結果如圖3所示。由圖3可見,酶解時間2～6 h,時間不斷延長,面包果淀粉提取率也不斷提高至61.32%,6 h時提取效果最佳,6 h后淀粉提取率趨于穩定。隨著酶解時間的延長,包裹在淀粉分子外的蛋白質被中性蛋白酶不斷水解,面包果淀粉分子不斷與蛋白質分離并釋放,從而提高面包果淀粉提取率[22]。當達到一定酶解時間后,與中性蛋白酶親和力強的底物蛋白質基本被酶解,進而被此類底物蛋白包裹的淀粉最大程度被釋放,而一部分與中性蛋白酶無作用的底物蛋白依舊與淀粉分子牢牢結合,提取過程中隨水分流失,因而提取率趨于平穩[23]。故選取4、6、8 h進行響應面優化試驗。

圖3 酶解時間對面包果淀粉提取率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis timeon the extraction rate of breadfruit starch

圖4 加酶量對面包果淀粉提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme dosageon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.4 加酶量對面包果淀粉提取率的影響 加酶量對面包果淀粉提取率的影響如圖4所示。由圖4可見,在加酶量0.05%～0.125%范圍內,面包果淀粉提取率從58.83%增加至64.94%,然而加酶量在0.125%～0.175%范圍內時,提取率則下降至59.57%。故得出加酶量為0.125%時,酶解提取效果最好。由酶促反應動力學可知,加酶量是限制酶促反應速率的主要因素,當反應體系中酶濃度較低時,中性蛋白酶濃度與酶促反應速率呈正比[24]。當酶濃度達到飽和后,面包果淀粉提取率出現下降趨勢,這是由于酶發生彼此黏附,導致酶解率降低,提取率下降。故選取加酶量0.1%、0.125%、0.15%進行后續響應面優化實驗。

2.2 面包果淀粉提取工藝響應面法優化

2.2.1 模型建立與方差分析 根據表1選定的響應面考察因素和水平,通過Box-Behnken方法設計得到29組試驗,具體設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合試驗設計及結果Table 2 The design and results ofBox-Behnken cenral composite test

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行分析,得到面包果淀粉提取率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=69.20+0.99A+2.02B+0.37C+2.18D+0.51AB+0.07AC-1.18AD+0.30BC+1.81BD+0.89CD-5.15A2-5.35B2-5.31C2-7.78D2

由表3可知,料液比、酶解溫度和加酶量對面包果淀粉提取率影響均極顯著(P<0.01),且各因素對提取率影響程度為:D>B>A>C,即加酶量>酶解溫度>料液比>酶解時間。料液比和加酶量、酶解溫度和加酶量交互作用的影響極顯著(P<0.01),酶解時間和加酶量交互作用的影響顯著(P<0.05),料液比和酶解溫度、料液比和酶解時間以及酶解溫度和酶解時間交互作用對提取率的影響不顯著(P<0.05)。對于模型的二次項來說均影響極顯著(P<0.01)。

2.2.2 各因素交互作用影響 響應面圖可以更加直觀形象地反映出各單因素以及各單因素之間交互影響的強弱關系[25]。響應面中,固定某個因素,改變另一個因素引起響應值變化,如果響應面走勢較陡,說明該因素對響應值影響顯著,反之則不顯著[26]。響應面優化模型因素(料液比、酶解溫度、酶解時間和加酶量)兩兩交互作用對面包果淀粉提取率影響的響應面曲面圖如圖5所示。

由圖5a分析可知,料液比和加酶量交互作用對面包果淀粉提取率影響的等高線為橢圓形,說明料液比和加酶量交互作用對面包果淀粉提取率的影響顯著。當加酶量不變時,隨著料液比的增加,提取率呈現先上升后下降的趨勢;當料液比不變時,隨著加酶量增加,提取率也呈現先增加后減小的趨勢。當料液比為1∶4.1,加酶量為0.13%,提取率達到最大值。圖5b、圖5c和圖5d反映了料液比和酶解溫度、料液比和酶解時間以及酶解溫度和酶解時間交互作用對提取率的影響,對提取率影響的等高線都近似圓形,說明此因素對結果影響不顯著。當固定一個變量,提取率會隨另一個變量的增大先上升后下降,但隨著因素值的改變,提取率變化不明顯。當料液比為1∶4.1,溫度為62 ℃,時間為6 h,提取率達到最大值。從圖5e可以看出酶解溫度和加酶量交互作用對提取率影響的等高線為橢圓形,且由曲面圖可以看出,結果隨因素改變的變化明顯,說明此因素交互作用對結果影響顯著,在溫度為62 ℃,加酶量為0.13%,提取率最高。圖5f為酶解時間和加酶量交互作用對提取率的影響,等高線圖為較扁的橢圓形,說明對提取率的影響較為顯著,隨著因素的增加,提取率先增加,在時間6 h,加酶量0.13%時達到最大值,然后提取率出現下降趨勢。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖5 各因素交互作用對面包果淀粉提取率的影響Fig.5 Effect of interaction between various factors on the extraction rate of breadfruit starch

2.2.3 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析優化,得出中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工藝條件為料液比1∶4.09 g/mL、酶解溫度62.22 ℃、酶解時間6.11 h、加酶量0.13%,此條件下面包果淀粉提取率的預測值為69.66%。

為了驗證響應面試驗優化的可行性,選擇優化后的條件進行酶法提取面包果淀粉的驗證實驗。考慮到操作的可行性,將上述最佳條件調整為料液比1∶4 g/mL、酶解溫度62 ℃、酶解時間6 h、加酶量0.13%,在此條件下進行3次重復實驗,得到的提取率為69.97%±0.14%,與回歸方程理論面包果淀粉提取率69.66%相吻合,說明響應面法優化后得到的最佳工藝參數準確可靠,該回歸模型具有較好的預測效果。

3 結論

通過響應面法優化面包果淀粉的中性蛋白酶法提取工藝,以面包果淀粉的提取率為響應值進行響應面分析,得到以下結論:各因素對面包果淀粉提取率的影響程度為:加酶量>酶解溫度>料液比>酶解時間。料液比和加酶量、酶解溫度和加酶量交互作用的影響極顯著(P<0.01),酶解時間和加酶量交互作用的影響顯著(P<0.05)。中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工藝參數為:料液比1∶4 g/mL、酶解溫度62 ℃、酶解時間6 h、加酶量0.13%。在最佳條件下得到的面包果淀粉實際提取率為69.97%,與理論值69.66%相吻合。