底圩茶多糖的超聲波輔助提取及其抗氧化活性

陳紅惠,牛念拉姆

(文山學院化學與工程學院,云南文山 663099)

底圩茶是云南省特有的歷史名茶之一,其茶味絕美,種植歷史悠久,因其產于廣南底圩鄉而得名。優良的茶樹品種和得天獨厚的氣候環境使底圩茶形成了獨特的品質,底圩茶用于制作綠茶,其茶湯色澤鮮綠,味鮮回甘,此外還有紅茶、白茶、黃茶等多個品種,市場知名度高,同時底圩茶也是制取普洱茶的主要原料[1]。深入開發底圩茶產品,對于提高產品附加值具有重要意義。

底圩茶除了含有常見的茶多酚、咖啡堿等成分外,還含有大量的多糖活性物質[2]。現代研究表明,多糖能顯著降低血糖,防治糖尿病,還具有抗氧化、抗腫瘤、調節機體免疫力等功效[3]。近年來,植物源性生物活性化合物及其提取物作為促進人體健康的營養保健品的需求和應用日益增加[4],因此,從植物中提取多糖越來越受到人們的重視。由于多糖具有良好水溶性,其提取方法多采用熱水提取,但該方法存在耗時、能耗大、得率低等缺點。近年來,具有提取時間短、溶劑環保、產品回收率高、成本低的綠色提取技術已成為提取研究熱點和方向。超聲波提取法以聲波產生機械效應、空穴效應破壞植物原料,可有效提高溶劑萃取率,已被廣泛應用,但超聲波法在底圩茶多糖提取及抗氧化性研究未見報道[5]。本研究以廣南底圩茶為對象,探討超聲波輔助技術提取底圩茶的相關因素與得率的關系,利用正交試驗確定底圩茶多糖超聲波輔助提取的最優條件,并研究了底圩茶多糖抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

底圩茶 產于云南省廣南縣底圩鄉;葡萄糖標準品(純度>98%) 北京中科儀友化工技術研究院;2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(純度>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(純度>98%)、Tris、蒽酮、硫酸、鹽酸、無水乙醇、抗壞血酸、水楊酸、鄰苯三酚、過氧化氫、過硫酸鉀、三氯甲烷(分析純) 南京化學試劑有限公司。

FRQ-1008HT型超聲波清洗器 杭州法蘭特超聲波科技有限公司;RE-2000E(2L)旋轉蒸發器 南通普瑞科技儀器有限公司;FC-18A真空冷凍干燥機 河北國輝實驗儀器有限公司;LB-721可見分光光度計 青島路博偉業環保科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 底圩茶樣品預處理與多糖提取 將底圩茶在55 ℃下烘至恒重,粉碎過篩,置于棕色瓶內保存。準確稱取一定質量底圩茶粉末,用無水乙醚進行脫脂處理,在合適的溫度、料液比、超聲功率、時間條件下超聲提取,提取兩次,結束后進行減壓過濾,收集濾液并經旋轉蒸發濃縮,往濃縮液中加入無水乙醇,于-4 ℃靜置過夜,將醇沉物質進行離心,收集沉淀并進行真空冷凍干燥處理,得底圩茶粗多糖樣品[6]。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 原料顆粒度的確定 稱取不同粒度(20、40、60、80、100目)的底圩茶粉2.0 g于三角瓶中,固定60 ℃的提取溫度,600 W的超聲波功率,1∶30 g/mL的料液比,90 min的超聲時間條件,考察原料顆粒度與底圩茶多糖得率的關系。

1.2.2.2 料液比的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)蒸餾水,設置超聲水浴溫度60 ℃,超聲波功率600 W,超聲提取90 min,考察料液比與底圩茶多糖得率的關系。

1.2.2.3 超聲時間的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,固定600 W的超聲波功率,60 ℃的提取溫度,1∶30 g/mL的料液比條件,分別提取30、50、70、90、110 min,考察超聲時間與底圩茶多糖得率的關系。

1.2.2.4 提取溫度的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸餾水,設置超聲功率600 W,改變超聲水浴溫度為20、30、40、50、60 ℃,在超聲波提取器中提取90 min,考察提取溫度與底圩茶多糖得率的關系。

1.2.2.5 超聲功率的確定 稱取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸餾水,設置超聲水浴溫度為60 ℃,改變超聲功率為450、525、600、675、750 W,在超聲波提取器中提取90 min,考察提取溫度與底圩茶多糖得率的關系[7-9]。

1.2.3 底圩茶多糖超聲提取的正交優化試驗 分析單因素實驗結果,明確各因素間相互影響對底圩茶多糖得率的影響,多糖得率隨原料粒度變化增加不明顯,選擇對多糖得率有顯著影響的料液比、超聲時間、提取溫度三個因素進行正交試驗[10-11],其因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 底圩茶多糖得率的測定 底圩茶多糖含量采用蒽酮-硫酸法測定[12]。標準物質為葡萄糖,于620 nm測定吸光值,繪制標準曲線。回歸方程中橫坐標為葡萄糖濃度(mg/mL),縱坐標為吸光值,得到方程為y=0.5033x+0.0062,決定系數R2=0.9993。根據式(1)計算底圩茶多糖得率:

式(1)

式中:c:根據標準曲線計算出的多糖質量濃度,mg/mL;v:底圩茶多糖提取液總體積,mL;m:稱取的底圩茶質量,g。

1.2.5 底圩茶粗多糖的純化 在正交實驗優化條件下提取底圩茶粗多糖溶液,經旋轉蒸發濃縮后往其中加入30% H2O2至糖液體積的15%,于50 ℃水浴下保溫1 h,除去提取液中色素。取脫色后的底圩茶多糖粗提液,加入等體積Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1,V/V),劇烈振搖,棄去下層蛋白,重復操作5次。取脫蛋白后的水相進行流水透析48 h,將透析液進行濃縮,濃縮液中加入無水乙醇,置于-4 ℃靜置過夜,離心取沉淀,用無水乙醚、丙酮反復洗滌后進行冷凍干燥,得到底圩茶多糖。稱取一定質量純化后的底圩茶多糖,用蒸餾水溶解,配制不同濃度(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的底圩茶多糖待測液,用于抗氧化活性測定。

1.2.6 底圩茶多糖抗氧化活性測試

式(2)

1.2.6.2 羥基自由基(·OH)清除作用 參考丁世環等[15-19]方法略作修改進行測定。分別取2.0 mL硫酸亞鐵(9 mmol/L)、1.0 mL鄰二氮菲溶液(0.75 mmol/L)于7支試管中,1號試管加入2.0 mL蒸餾水,從2號到7號試管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測液各2.0 mL,最后每個試管再加入2.0 mL H2O2溶液(6 mmol/L),設置水浴鍋溫度37 ℃,放入試管保溫30 min,510 nm時測定各試管的吸光值。其中,第1支試管的吸光值計為A0,第2～7支試管的吸光值計為Ax,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的過氧化氫用蒸餾水代替,測得的吸光值計為Ay,羥基自由基清除率計算公式為式(3)。

式(3)

1.2.6.3 DPPH自由基(DPPH·)清除作用 參考王麗波等[20-23]的方法進行適當修改。取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測液2.0 mL于2～7號試管中,1號試管加入2.0 mL蒸餾水,在每個試管中加入2.0 mL DPPH溶液(甲醇配制,0.1 mmol/L),混合均勻后,避光30 min后測定各試管的吸光值(515 nm)。其中,第1支試管的吸光值計為A0,第2～7支試管的吸光值計為Aa,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的DPPH用甲醇代替,測得的吸光值計為Ab,DPPH自由基清除率計算公式為式(4)。

式(4)

1.2.6.4 ABTS自由基(ABTS+·)清除作用 參考閆亞美等[24-29]方法進行適當修改。取2.0 mL ABTS工作液于7支試管內,第1支加入0.5 mL蒸餾水,從2號管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待測液,混合均勻,10 min后測定各試管的吸光值(734 nm)。其中,第1支試管的吸光值計為A0,第2～7支試管的吸光值計為Aa,采用同樣方法,第2～7支試管中加入的ABTS用甲醇代替,測得的吸光值計為Ab,ABTS自由基清除率計算公式為式(5)。

式(5)

1.3 數據處理

以上每個試驗均在相同水平條件下進行3次,運用SPSS 17.0軟件進行數據處理和統計分析,圖形繪制采用GraphPad Prism 8.0軟件。

2 結果與討論

2.1 底圩茶多糖超聲波輔助提取單因素實驗

2.1.1 原料粒度對底圩茶多糖得率的影響 原料粒度大小影響提取溶劑與物料接觸面積,顆粒過大,得率低,但顆粒過小,原料容易堆積結塊,反而不利于溶劑滲透,提取不完全,同時也造成多糖過濾分離困難。如圖1所示,40目的原料提取的多糖得率最高,為7.33%±0.19%;原料粒度增加,底圩茶多糖的得率卻有所下降。因此控制原料粒度在40目左右較適宜。

圖1 原料粒度對底圩茶多糖得率的影響Fig.1 Effects of granularity on yield ofpolysaccharide from Dixu tea注:不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 料液比對底圩茶多糖得率的影響 在實際生產和應用中,料液比也是一個非常重要的因素。溶劑體積充足可確保樣品充分浸沒,有利于在提取過程中溶質的溶出。因此,本實驗考慮了料液比對目標化合物多糖得率的影響。如圖2所示,在試驗設計的料液比范圍內時,底圩茶多糖得率出現顯著增加(P<0.05),但料液比大于1∶30 g/mL時,溶劑過多,會增加萃取過程的復雜性,造成不必要的浪費,此外溶劑增加對于后期多糖分離純化效率也有較大影響,因此,從經濟學角度看,原料與溶劑的比例為1∶30 g/mL比較適宜。

圖2 不同料液比對底圩茶多糖得率的影響Fig.2 Effects of material-liquid ratioon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.3 超聲時間對底圩茶多糖得率的影響 一般來說,植物中有效成分的提取與時間有密切關系,時間短,有效成分未能充分溶解釋放,時間過長,可能會造成化合物分解,降低其活性。充分的超聲時間可促進多糖較好地溶解釋放。如圖3所示,初始時間從30 min開始,底圩茶多糖的得率明顯上升,而進一步增加時間得率并未提高,反而下降,這表明90 min的超聲可為原料細胞壁破裂提供充分分解時間。因此90 min為適宜的超聲時間。

圖3 不同超聲時間對底圩茶多糖得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time onyield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.4 提取溫度對底圩茶多糖得率的影響 由圖4所示,當提取溫度在20～50 ℃變化時,隨著溫度增加,多糖分子運動加快,原料在超聲條件下的空化效應越明顯,有利于多糖從細胞結構內部溶解析出,得率呈現顯著增加趨勢(P<0.05),當溫度為50 ℃時,底圩茶粗多糖得率最高,為10.24%±0.12%。當溫度過高,會破壞多糖的糖苷結構,引起部分多糖分解,得率會有所下降。因此,基于能耗和得率的考慮,提取底圩茶多糖的溫度在50 ℃較適宜。

圖4 不同提取溫度對底圩茶多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic temperatureon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.5 超聲功率對底圩茶多糖得率的影響 超聲過程要形成較強的空化效應,需要溶劑產生合適的剪切力和進行湍流流動,這與超聲功率有密切關系。如圖5所示,超聲功率在設計的范圍內,底圩茶多糖得率水平出現顯著提高(P<0.05),從7.64%±0.20%增至10.24%±0.14%。由于在超聲波清洗器的最大功率750 W下,底圩茶多糖得率最高,故對其工藝優化時固定超聲功率為750 W,后續不再進行考察。

圖5 不同超聲功率對茶多糖得率的比較Fig.5 Effects of ultrasonic poweron yield of polysaccharide from Dixu tea

2.2 正交試驗結果

由表2所示,通過對底圩茶多糖得率的極差分析,影響底圩茶多糖的因素中影響最重要的因素是料液比。在正交試驗設計的范圍,底圩茶多糖超聲波輔助提取的最佳因素水平為:A3B3C3,選擇料液比為1∶40 g/mL,在提取溫度60 ℃下提取110 min,可得到最高多糖得率。由表3所示,因素A(料液比)對底圩茶多糖提取影響顯著(P<0.05),因素B(超聲時間)、因素C(提取溫度)沒有顯著性影響(P>0.05),在正交試驗設計水平范圍內,超聲時間和提取溫度對底圩茶多糖提取影響不大。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

2.3 驗證試驗

稱取40目底圩茶粉2.00 g,根據正交試驗結果得到的底圩茶多糖的最優提取條件,即加入料液比1∶40 g/mL的蒸餾水,超聲波功率設定為750 W,在60 ℃下進行超聲提取110 min。試驗進行三次重復,得到多糖平均得率為11.28%±0.49%,表明該優化工藝條件穩定,準確性高。

2.4 底圩茶多糖抗氧化活性研究

圖6 底圩茶多糖對和ABTS+·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of Diwei tea polysaccharides on 和ABTS+·

2.4.2 底圩茶多糖對·OH清除作用 羥基自由基是使生物體損傷最嚴重的活性氧自由基,具有穿透生物膜能力,能夠嚴重破壞蛋白質、脂質、核酸等生物分子,引起機體發生衰老、癌癥及其他疾病。·OH氧化能力極強,通過多糖對Fe2+進行螯合,可以減少·OH的產生。如圖6b所示,多糖濃度由0.2 mg/mL提高至1.6 mg/mL,底圩茶多糖對·OH的清除效果增強,濃度為1.6 mg/mL時,其對·OH清除率迅速上升至83.30%±1.74%,多糖濃度高于1.6 mg/mL時,清除率增幅變小,濃度為2.0 mg/mL時,底圩茶多糖對·OH清除率為85.17%±1.70%,擬合曲線計算得到底圩茶多糖對·OH的IC50值為0.16 mg/mL,而VC的IC50值為0.03 mg/mL,說明底圩茶多糖對·OH清除能力不及VC。

2.4.3 底圩茶多糖對DPPH·清除作用 由于抗氧化物質能將紫紅色的DPPH自由基還原為黃色的二苯肼。DPPH·被清除主要與抗氧化劑的供氫能力有關,常用作評價體外抗氧化試驗研究的主要方法。如圖6c所示,在測試的濃度范圍內,底圩茶多糖均對DPPH·有明顯且穩定的清除作用,底圩茶多糖濃度對DPPH·清除效果有正相關量效關系,清除率從36.99%±2.15%提高至66.48%±2.99%,擬合曲線計算得到底圩茶多糖和VC對DPPH·的IC50值分別為0.614和0.023 mg/mL。盡管底圩茶多糖與VC相比,在相同濃度下,多糖對DPPH·清除能力低于VC,但仍表現出良好的量效關系。

2.4.4 底圩茶多糖對ABTS+·清除試驗 ABTS形成的水溶性自由基很穩定,一般用于抗氧化物質總抗氧化能力測定的常用指標。如圖6d所示,對ABTS+·的清除試驗中底圩茶多糖效果明顯,在試驗設計濃度范圍,底圩茶多糖濃度增加,ABTS+·清除能力也隨之增強,當多糖濃度為2 mg/mL時,其對ABTS+·清除率最高達82.37%±1.00%。清除率與底圩茶多糖質量濃度符合正相關關系,擬合曲線計算得到底圩茶多糖和VC對ABTS+·的IC50值分別為0.046和0.024 mg/mL,表明底圩茶多糖清除ABTS+·能力較強,清除效果與VC相近。

3 結論