紫蘇籽蛋白對免疫力低下小鼠免疫調節功能的研究

朱 艷,姜 盛,李明亮,董 哲,王雨晴,郭 穎,*,谷瑞增,*

(1.中國食品發酵工業研究院有限公司,北京 100015; 2.華狐生物科技(中國)有限公司,遼寧沈陽 110000)

紫蘇是我國種植歷史悠久的一種藥食同源植物,具有潤肺止咳、下氣消痰、寬腸、止痛、安胎的功效[1]。紫蘇籽出油率40%～50%,且α-亞麻酸的含量高達60～70%左右,居所有植物之首[2]。因此,對紫蘇籽的研究主要集中在對紫蘇油的開發和利用方面。紫蘇油提取后的副產物紫蘇籽粕中蛋白質含量高達28%～33%,富含人體必需的8種氨基酸以及兒童必需的10種氨基酸,是一種優質的植物蛋白[3-4]。目前對紫蘇籽粕的研究主要集中在紫蘇分離蛋白的提取、蛋白質功能性質的檢測以及酶解紫蘇蛋白制備活性肽等方面[5-8]。但是對紫蘇蛋白的生物功能方面的研究并不多見,深入探索紫蘇蛋白的生物功能,對紫蘇蛋白商業價值的提高具有重要意義。

現代研究表明,多種疾病的發生都與免疫系統紊亂密切相關,比如衰老、癌癥、抑郁癥等[9-11],因此增強機體免疫力對預防疾病的發生具有重要作用。然而目前存在的免疫調節化學藥物具有用藥時間長、藥物殘留、環境污染等缺點[12],而植物蛋白是一類潛在的天然免疫調節劑,對機體毒害小[13],是近年來國內外學者研究的重點。研究表明,紫蘇籽蛋白具有消炎止痛的功效,經常食用含紫蘇籽蛋白的產品,能夠提高機體抗氧化能力,增強體質并延緩衰老[14],因此,紫蘇籽蛋白具有很好的調節機體免疫力的潛力。因此,本實驗以環磷酰胺(CTX)建立免疫低下小鼠模型,探討紫蘇籽蛋白其免疫系統調節作用,以期對未來相關產品的開發以及其它生物活性的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康Balb/c雌性小鼠(動物許可證:SCXK(京)2016-0006) 6～8周齡,16～18 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼料和墊料也由該公司提供,小鼠飼養于SPF級動物房內,實驗期間維持環境溫度為(22～24) ℃,適應性飼養1周后用于實驗;紫蘇籽蛋白 實驗室自制;左旋咪唑 北京索萊寶生物技術有限公司;小鼠淋巴瘤細胞YAC-1 上海冠導生物工程有限公司;RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS) Hyclon公司;青霉素/鏈霉素、胰酶、紅細胞裂解液、CCK-8 碧云天生物技術研究所;補體、15%綿陽紅細胞(SRBC)、0.33%中性紅染色液、0.4%臺盼藍染色液 北京索萊寶生物工程有限公司;MTT、刀豆蛋白Con A、脂多糖LPS Sigma Aldrich公司;TNF-α、IL-2酶聯免疫檢測試劑盒 北京百智生物科技有限公司。

BD C6流式細胞儀、240i直熱式二氧化碳培養箱 美國Thermofisher公司;CKX-4倒置相差顯微鏡 日本奧里巴斯有限公司;Spectra MR多功能酶標儀 美國Dynex公司;721型紫外分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫蘇籽蛋白的制備 紫蘇籽粕→破碎→一次堿溶(50 ℃、pH=10)→離心→二次堿溶(50 ℃、pH=9)→離心→酸沉(用HCl調pH至4.4)→離心→解碎、調漿中和(pH調至7.2)→過濾→均質→滅菌→噴霧干燥→紫蘇籽蛋白

1.2.2 實驗動物分組和給藥 健康Balb/c雌性小鼠54只,隨機分為空白組、模型組、陽性對照組(左旋咪唑30 mg/kg)、紫蘇籽蛋白低、中、高劑量組,成人(按照60 kg體質量計算)每日推薦攝入量為3 g,試驗采取人體推薦攝入量的2倍、1倍、0.5倍分別作為高(1200 mg/kg)、中(600 mg/kg)、低(300 mg/kg)劑量對小鼠進行灌胃。每組6只,每天一次灌胃給藥,空白組和模型組給予等體積的生理鹽水,持續28 d。除空白組外,每組每天按照40 mg/kg腹腔注射CTX,連續3 d,后每隔一周注射一次,注射劑量為80 mg/kg,空白組腹腔注射等體積生理鹽水,建立免疫力低下小鼠模型[15]。末次給藥后,小鼠禁食不禁水12 h,處死小鼠,進行各項免疫指標的檢測。

1.2.3 小鼠體重和免疫器官重量的測定 給藥期間每隔3 d稱量一次體重,28 d后,小鼠斷食不斷水12 h,稱重后將小鼠斷頸處死,解剖取其胸腺和脾,稱重,計算胸腺系數和脾臟系數。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞增殖能力的檢測 參考張瑞雪等[16]的實驗方法制備小鼠脾細胞懸液:小鼠斷頸處死后浸泡于75%酒精中5 min,隨后在無菌條件下分離脾,用剪刀將脾剪碎并研磨,研磨過程中不斷用滅菌的PBS沖洗,過200目尼龍篩網,收集濾液,1200 r/min離心5 min,棄上清,加入2 mL紅細胞裂解液重懸細胞,室溫裂解2～3 min,離心棄上清,用RPMI-1640不完全培養基清洗1～2次,將其重懸于含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中,得到脾細胞懸液,臺盼藍染色確定細胞存活率大于95%方可用于實驗。用RPMI-1640完全培養基調整細胞密度為5×106個/mL接種于96孔板,每孔90 μL,再向每孔添加10 μL Con A/LPS,使其終濃度為15 μg/mL,每組6個復孔,于37 ℃、5% CO2培養箱中誘導培養72 h,向每孔添加10 μL CCK-8,繼續孵育2 h,用酶標儀于490 nm處測OD值,空白組為灌胃生理鹽水小鼠淋巴細胞,小鼠淋巴細胞的增殖能力用刺激指數(SI)表示:

1.2.5 小鼠血清溶血素的測定 小鼠持續灌胃24 d后,腹腔注射0.2 mL體積分數為2%的SRBC致敏,4 d后摘眼球取血,4 ℃過夜放置,分離血清。實驗時,用生理鹽水將血清稀釋200倍后取血清樣品1 mL、10% SRBC 0.5 mL、10%補體1 mL于離心管中,用生理鹽水代替血清作為對照,37 ℃水浴30 min,冰浴終止反應,3500 r/min離心10 min取上清,用紫外分光光度計測定540 nm處的吸光度值,以生理鹽水作為空白調零[17]。

1.2.6 小鼠NK細胞殺傷力的測定

1.2.6.1 靶細胞的準備 選取小鼠淋巴瘤細胞(YAC-1細胞)作為靶細胞。細胞培養在含10% FBS、1% 青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中,每2 d換一次液,待細胞長滿培養瓶的80%左右,按照1∶3進行傳代培養。實驗時,對細胞進行臺盼藍染色,確定細胞活性大于95%即為靶細胞。實驗時,用RPMI-1640完全培養基調整細胞密度為1×105個/mL。

1.2.6.2 NK細胞殺傷力的測定 用RPMI-1640完全培養基調整脾細胞懸液密度為5×106個/mL,作為效應細胞。實驗組向U型96孔板中加入效應細胞和靶細胞各100 μL,保證效靶比為50∶1,設置靶細胞YAC-1對照孔,添加100 μL YAC-1細胞懸液和100 μL RPMI-1640完全培養基,另設效應細胞對照孔,添加100 μL 效應細胞懸液和100 μL RPMI-1640完全培養基。37 ℃孵育4 h后向每孔添加10 μL CCK-8,37 ℃繼續孵育2 h,用酶標儀于490 nm處測OD值[18],按照下面方法計算NK細胞殺傷率:

1.2.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的測定

表1 紫蘇籽蛋白對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Perilla frutescens seed protein on mice

1.2.7.1 巨噬細胞的制備 小鼠持續灌胃25 d后,給小鼠腹腔注射1 mL 4%淀粉肉湯溶液,3 d后斷頸處死小鼠[19],并在75%酒精中浸泡5 min,于無菌工作臺上剝離腹部皮膚,注意不要剪破腹腔膜,用一次性注射器向其腹腔內注射3 mL無菌PBS,輕輕按摩腹部2～3 min,收集腹腔液,1200 r/min離心5 min,棄上清,用不完全RPMI-1640培養基清洗2次,收集沉淀,并重懸于RPMI-1640完全培養基中,臺盼藍染色確定細胞活性大于95%,調整細胞密度為5×106個/mL,取96孔板,每孔加入100 μL細胞懸液,37 ℃培養2.5 h,吸棄培養基,并洗去未貼壁細胞,再向每孔加入100 μL完全培養基,即得到單層巨噬細胞。

1.2.7.2 巨噬細胞吞噬能力測定 得到的單層巨噬細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養24 h,吸棄培養液,調整細胞濃度為1×106個/mL,繼續培養2.5 h使其貼壁,再每孔加入100 μL 0.1%中性紅溶液,繼續培養1 h,用PBS洗去未被吞噬的中性紅,每孔加入100 μL細胞裂解液(含體積分數1%的乙酸和50%的乙醇),室溫放置2～3 h,待細胞溶解后,用酶標儀測定559 nm處吸光度值,空白組為灌胃生理鹽水小鼠腹腔巨噬細胞,并計算吞噬指數(PI):

1.2.8 小鼠血清IgG、IL-2含量的測定 小鼠禁食12 h后,用乙醚麻醉,摘眼球采血,分離血清,用酶聯免疫檢測試劑盒測定血清中IgG和IL-2含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 紫蘇籽蛋白對小鼠體重和免疫器官重量的影響

胸腺和脾臟是機體兩大重要免疫器官,胸腺是T淋巴細胞分化、發育和成熟的場所,脾臟是T、B淋巴細胞儲存和發揮作用的場所[20],因此它們的增重往往代表著淋巴細胞的增殖,從而直接體現了免疫應答的強弱[21]。表1為灌胃期間小鼠體重、胸腺系數和脾臟系數的變化,由數據可知,28 d后,模型組小鼠體重與空白組相比增加不明顯,不同劑量的紫蘇蛋白均能增加小鼠體重。與空白組相比,模型組小鼠脾臟系數和胸腺系數極顯著降低(P<0.01),與模型組相比，中劑量的紫蘇籽蛋白顯著增加免疫低下小鼠的脾臟系數(P<0.05),并極顯著的增加了胸腺指數(P<0.01),可見紫蘇籽蛋白很好的延緩CTX引起的免疫器官縮減。

2.2 紫蘇籽蛋白對T/B淋巴細胞增殖能力的影響

淋巴細胞是免疫系統中主要的免疫細胞,其中T/B淋巴細胞承擔著機體內的體液免疫和細胞免疫,它們可分別由刀豆蛋白(Con A)和脂多糖(LPS)誘導活化,其增殖活化決定了淋巴細胞的數量,影響著免疫水平的強弱,為常見的免疫檢測指標[22-23]。

如圖1所示為紫蘇籽蛋白對免疫低下小鼠T/B淋巴細胞增殖的影響。與空白組相比,CXT導致小鼠脾淋巴細胞的增殖極顯著降低(P<0.01),模型建立成功。與模型組相比,低劑量的紫蘇籽蛋白顯著促進了B淋巴細胞的增殖(P<0.05),隨著濃度的增加,紫蘇籽蛋白對T/B淋巴細胞的增殖呈現先增加后降低趨勢,其中,中劑量的紫蘇籽蛋白對免疫力低下小鼠T/B淋巴細胞的增殖效果較模型組均具有極為顯著的差異(P<0.01),所以適量攝入紫蘇籽蛋白對細胞免疫和體液免疫均能起到增強效果,而過量蛋白的攝入可能增加了小鼠的代謝負荷,反而影響免疫功能的發揮[24]。

圖1 紫蘇籽蛋白對小鼠T/B淋巴細胞增殖影響Fig.1 Effect of Perilla frutescens seed proteinon T/B lymphocyte proliferation in mice

2.3 紫蘇籽蛋白對血清溶血素含量的影響

血清溶血素是B淋巴細胞接觸到特異性抗原,即綿陽紅細胞SRBC后產生的特異性抗體,其含量多少體現了機體釋放特異性抗體的能力[25]。小鼠經SRBC免疫后產生的特異性抗體主要存在血清中,它與SRBC和補體在一定條件下會引起SRBC發生溶血,溶血程度與分泌的抗體量相關[26],因此血清溶血素的含量是反應機體體液免疫強弱的一個重要指標。

如圖2所示,紫蘇籽蛋白能很好地提高免疫力低下小鼠血清溶血素水平,中劑量的紫蘇籽蛋白極其顯著提高了免疫力低下小鼠血清半數溶血值(P<0.01),且相比于陽性藥物左旋咪唑的效果無明顯差異(P>0.05)。因此,中劑量紫蘇籽蛋白具有較強的免疫調節作用,且效果與左旋咪唑相當。

圖2 紫蘇籽蛋白對小鼠血清血溶素含量的影響Fig.2 Effect of Perilla frutescens seed proteinon serum lysin content in mice

2.4 紫蘇籽蛋白對小鼠NK細胞殺傷力的影響

NK細胞(自然殺傷力細胞)是淋巴細胞的一種,是天然存在于生物體內非特異性的免疫細胞,在無抗原刺激和抗體存在的情況下能夠直接溶解和清除些腫瘤細胞和病毒感染的細胞[27],目前NK細胞被認為是免疫監視細胞中最理想的效應細胞。

圖3為紫蘇籽蛋白和對免疫低下小鼠NK細胞殺傷力的影響,可以看出,正常小鼠腹腔注射CTX后,NK細胞殺傷力降低,免疫力極顯著降低(P<0.01)。紫蘇籽蛋白能較好的提高免疫低下小鼠NK細胞殺傷力,且在低劑量組下就能顯著地提高NK細胞殺傷力(P<0.05),中劑量組下極顯著地提高了NK細胞殺傷力(P<0.01),繼續增加蛋白濃度,效果變弱,但仍顯著提高了免疫低下小鼠NK細胞的殺傷力能力。相比而言,左旋咪唑對NK細胞殺傷力的影響較弱,中劑量的紫蘇籽蛋白提高NK細胞殺傷力的功效較之增加了9.4%。

圖3 紫蘇籽蛋白對小鼠NK細胞殺傷力的影響Fig.3 Effect of Perilla frutescens seed proteinon NK cell lethality in mice

2.5 紫蘇籽蛋白對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

非特異性免疫是機體免疫系統的重要組成部分,巨噬細胞能夠識別外來異物并能通過吞噬作用起到清除效果[28],其吞噬能力的強弱不僅代表著吞噬細胞的活性,而且在機體低于外來病原體入侵和維持內環境穩態等生命活動中占據重要作用[29]。吞噬中性紅的定量測定常用來評價吞噬細胞的吞噬能力。

如圖4所示,正常小鼠注射CTX后吞噬細胞吞噬指數極顯著降低(P<0.01),對免疫低下小鼠灌胃紫蘇籽蛋白后,小鼠內吞噬細胞吞噬異物能力提高,低劑量的紫蘇籽蛋白較模型組顯著提高了免疫低下小鼠腹腔吞噬細胞吞噬指數(P<0.05),隨灌胃濃度增加,效果減弱。但是低劑量和中劑量的紫蘇蛋白在增強小鼠巨噬細胞吞噬能力方面并無顯著差異。因此,紫蘇籽蛋白能夠增強免疫低下小鼠非特異性免疫,但劑量不易過高。

圖4 紫蘇籽蛋白對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響Fig.4 Effect of Perilla frutescens seed protein onphagocytosis of peritoneal macrophages in mice

2.6 紫蘇籽蛋白對小鼠血清IL-2、IgG含量的影響

IL-2即白細胞介素-2是由T淋巴細胞產生的一種糖蛋白,它的生物學功能主要是促進T淋巴細胞的增殖和分化,介導細胞免疫應答[30],它也能夠促進B淋巴細胞的增殖，但不是B淋巴細胞增殖所必須的,增強NK細胞殺傷力,激活體內巨噬細胞,是評價細胞免疫功能的重要指標[31]。IgG是體液免疫應答中產生的主要的抗體,由B淋巴細胞分泌產生,約占全部抗體的80%,是反映體液免疫的常見指標[32]。

結果如表2所示,經CTX誘導后,正常小鼠體內IL-2和IgG含量均極顯著降低(P<0.01),說明CTX誘導免疫力低下小鼠模型建立成功。三個劑量下紫蘇籽蛋白對IL-2的分泌均起到了良好的促進效果,與模型組相比具有極為顯著差異(P<0.01),中劑量的紫蘇蛋白效果最強。高劑量的紫蘇蛋白對促進IL-2分泌的效果與陽性藥物左旋咪唑相當,但對B淋巴細胞的增殖與模型組相比并沒有表現出顯著的差異(P>0.05),這可能與IL-2主要是介導細胞免疫的生物學功能相關[30],免疫力低下小鼠過量攝入蛋白質,可能會增加小鼠代謝負荷,不利于免疫系統的恢復[24]。三個劑量組的紫蘇籽蛋白雖增加了免疫低下小鼠血清中IgG含量,但與模型組相比無差異,可見,紫蘇籽蛋白對小鼠細胞免疫具有更好的調節作用。

表2 紫蘇籽蛋白對小鼠血清中IL-2和IgG含量的影響Table 2 Effect of Perilla frutescens seed proteinon IL-2 and IgG levels in serum of mice

3 結論

本實驗探究了紫蘇籽蛋白對CTX誘導的免疫力低下小鼠的免疫調節作用,研究表明,連續28 d的灌胃紫蘇籽蛋白后,小鼠的脾臟指數和胸腺指數均增加,有效遏制了CTX引起的免疫器官的衰減。在細胞免疫中,隨著紫蘇籽蛋白濃度的增加,T/B淋巴細胞增殖率均呈現出先增加后降低的趨勢,中劑量的紫蘇籽蛋白對促進T/B淋巴細胞的增殖效果最好,同時顯著促進T淋巴細胞分泌IL-2,又反過來刺激細胞免疫和體液免疫的發生。中劑量的紫蘇籽蛋白對體液免疫也具有很好的調節效果,大量增加了免疫低下小鼠血清溶血素含量,但對促進B淋巴細胞分泌IgG效果不明顯,因此對體液免疫的調節功效也具有一定的調節作用。在非特異性免疫中,紫蘇籽蛋白對NK細胞殺傷力以及吞噬細胞吞噬能力均有一定程度的影響,相比于高劑量的紫蘇籽蛋白,低劑量和中劑量的效果更強。綜上所述,適量攝入紫蘇籽蛋白能夠很好的起到增強免疫力的效果,但是過量攝入則會帶來相反的結果。而關于紫蘇籽蛋白免疫調節的作用機制還需進一步實驗探究,為未來相關產品和保健品的開發提供新的思路。