食品中呈鮮味物質研究進展

郇思琪,劉登勇,2,*,王笑丹,張慶永

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心,江蘇南京 210095; 3.吉林大學食品科學與工程學院,吉林長春 130062; 4.山東德州扒雞股份有限公司,山東德州 253003)

食物的滋味有千百種,但是基本味只有五種:酸、甜、苦、咸、鮮[1]。其中,前四種基本味經過人們早期發現和長期探索,已明確了它們的感知機理,而作為第五位的鮮味則尤為特殊。一方面是由于鮮味常在食物中與其他味道結合在一起出現時,使人難以察覺,直到上個世紀初,才被日本池田菊苗教授發現并且正式命名,這使得人們對它的認識和研究起步較晚;另一方面則是由于它的感知受體結構尚未解析,呈味機理尚存爭議[2-3]。近年來,對于鮮味物質,已有明確分類,鮮味的呈味機理還在不斷探索中,而對于鮮味物質的檢測也從一開始較為簡易、粗略的化學分析法[4]、紫外分光光度法[5]等方法發展為高效準確的電子舌檢測[6]、氨基酸分析儀法[7]、高效液相色譜法[8]等。本文對于前人的研究進行綜述,從鮮味物質本身出發,對其提取、分類、感知機理、較新的檢測方法的研究進展進行總結,旨在為研究食品中的鮮味物質提供一定參考價值。

1 呈鮮味的食物

其實大多數的食材最初鮮味并不突出,只有經過烹調加工后,食材中的蛋白質分解轉化為小分子的多肽和游離氨基酸(Free amino acid,FAAs),核酸轉化為小分子的5′-核苷酸,鮮味才能得到更大化的呈現[9];另外,5′-核苷酸可以和鮮味游離氨基酸發生協同作用,達到1+1>2的效果,從而使得食物的鮮味更加濃郁。

食物之所以呈現鮮味,主要是因為食物中含有對鮮味貢獻較大的鮮味物質,其中最具有代表性的鮮味物質就是L-谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)、天門冬氨酸(Aspartic acid,Asp)、5′-鳥苷酸(5′-guanylic acid,5′-GMP)和5′-肌苷酸(Inosine 5′-monophosphate,5′-IMP)[10]。L-Glu主要存在于魚、大豆及其發酵制品中,5′-IMP主要存在于海鮮和畜禽肉類中,而5′-GMP則主要存在于菌類比如香菇中[11]。

影響食物的鮮味因素主要有養殖種植方法、加工處理方式、搭配食物及貯存方法。余昌霞等[12]探究了五種不同培養基質對草菇呈味物質的影響,發現以棉籽殼為基質所培養的草菇等鮮濃度值最高,粗蛋白及水解氨基酸含量及組成最優,說明棉籽殼可以作為優質鮮味草菇栽培的培養基質。Cai等[13]探究了4種不同干燥方式對中國對蝦風味的影響,發現利用微波真空-冷風聯合干燥后的對蝦等鮮值提高,且呈味游離氨基酸含量下降不嚴重,對于對蝦的鮮味變化影響最小。Sato等[14]研究了日本傳統綠茶對于日本料理的感官特性的影響,發現澀味較低的綠茶對于日本料理的鮮味具有協同增效的作用,同時能夠增加其厚味。Li 等[15]分別研究了低溫和超低溫貯藏對黃羽雞雞湯中揮發性和非揮發性風味物質的影響,結果發現與低溫貯藏相比,超低溫貯藏在21～24 d時,雞湯中的鮮味游離氨基酸與5′-核苷酸含量更高,這充分說明超低溫貯藏能夠有效延長鮮味物質的保存期。

鮮味來源于食物,目前增鮮劑的提取原材料及方法在不斷更新。現代傳統味精的工業生產原料是酵母,酵母是一種真菌,當單個酵母細胞分裂開,細胞自身的酶可以通過水解作用分解蛋白質,從而釋放出大量的谷氨酸,經過一系列的抽提精煉等過程便可制成味精[16-17]。近些年,常有研究以畜禽骨渣為原料提取鮮味風味良好的調味劑。Wang 等[18]運用熱壓萃取技術對雞骨渣中的蛋白質、膠原蛋白和礦物質等進行提取,將其轉化為一種營養的鮮味調味底物。Liao 等[19]以河豚頭部與尾部為原料,通過酶解和美拉德反應得到了熱穩定性良好且具有強烈鮮味的蛋白副產物。Xu 等[20]以牛骨髓為原料,通過酶解反應和熱反應可以得到肉香味和鮮味物質含量高,異味物質含量低的調味料。

2 鮮味的呈味物質

2.1 氨基酸

鮮味氨基酸的代表性物質主要有谷氨酸和天門冬氨酸兩種,然而只有它們的L-型構象能夠呈現鮮味,D-型異構體卻并無鮮味。L-谷氨酸擁有兩個羧基殘基,羧基殘基的解離常數是4.25,在中性pH條件下可以產生—COO-基團[21]。若將氫氧化鈉和谷氨酸混合,便可以得到具有明顯鮮味的谷氨酸鈉晶體,即味精的主要成分。由于鮮味是由谷氨酸結構中陰離子引起的,所以谷氨酸鉀和谷氨酸鈣也具有鮮味。谷氨酸熱穩定性較好,所以富含谷氨酸的食物經過高溫加熱后,依然能夠呈現良好的鮮味風味。不同食物中的L-Glu也不盡相同,雞肉、牛肉、豬肉的谷氨酸含量分別為44、33、23 mg/100 g[22-23]。天門冬氨酸與谷氨酸同屬于酸性氨基酸,它們倆也是僅有的兩種酸性氨基酸,天門冬氨酸不僅是食品工業領域常用的營養增補劑,而且在醫藥方面有著廣泛的應用,可以用來治療高血壓癥、緩解疲勞,作為氨解毒劑、肝功能促進劑等。

2.2 核苷酸

在5′-核苷酸中,5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP(Adenosine Triphosphate)對食品鮮味的貢獻最為突出。5′-IMP在畜禽肉中占主導地位,雞肉、牛肉和豬肉中的5′-IMP含量分別為115、163、186 mg/100 g。5′-IMP主要由細胞中的三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)分解產生,分解過程可以簡化為:ATP→ADP→AMP→IMP,這整個分解過程通常發生在動物死后的僵直期[24]。以大菱鲆為例,魚肉中的5′-IMP產生過程是在魚體死后進行的,魚肉中的5′-IMP的濃度在魚死后大約10 h能夠達到最高值,所以剛剛被殺死的魚并不如死后10 h的魚味道鮮美[25]。而5′-GMP主要存在于可食用菌中,干香菇中的5′-GMP含量為156.5 mg/100 g(是新鮮香菇的3倍),它是由核糖核酸酶分解核糖核酸產生的,香菇在干燥過程中,細胞破裂,細胞中的核糖核酸酶能夠充分作用于核糖核酸,使得干香菇中的5′-GMP含量得到明顯提升。而干香菇在烹飪前,需要用冷水泡發,這是因為在室溫下5′-GMP容易被核苷酸酶分解為鳥苷,烹飪時的溫度也應迅速提升至60～70 ℃以避免大量的5′-GMP的分解和流失[26]。5′-AMP主要存在于貝類或軟體動物中,扇貝、魷魚和龍蝦中的5′-AMP含量分別為116、184、82 mg/100 g。

2.3 肽

除了氨基酸和核苷酸,一些小分子多肽也表現出鮮味。時至今日,據統計已有75種多肽具有鮮味[27],包括24種二肽、17種三肽、4種四肽、5種五肽、8種六肽、4種七肽、8種八肽、2種九肽、2種十一肽和1種十五肽,其中Asp與丙氨酸形成的二肽呈現強烈的鮮味,Asp與Glu形成的二肽同時呈現咸味和鮮味,而Glu、絲氨酸、亮氨酸和丙氨酸形成的四肽則同時呈現酸味、鮮味和苦味,其中酸味>鮮味>苦味。在這75種鮮味肽中仍有20種多肽(包括14個二肽、5個三肽和1個八肽)的味道存在爭議,即存在幾種多肽從水解物中分離出來時可以表現出鮮味的,但當通過人工合成方法得到時卻不能呈現鮮味[28]。這有可能是因為:a.水解產生的鮮味多肽與合成產生的鮮味多肽在空間結構上的差異可能影響了鮮味多肽的風味分析,多肽合成過程中氨基酸異構形式引起的空間結構變化可能影響肽的鮮味;b.鮮味多肽與其他化合物的相互作用可能會干擾其呈鮮機制[29]。

2.4 有機酸

呈鮮味的有機酸類主要有琥珀酸鹽、沒食子酸、五倍子酸。其中琥珀酸鹽最具代表性,琥珀酸二鈉(Succinic acid disodium salt)是有機酸呈現鮮味的代表物質,它多存在于貝類及香菇中。具有較好的穩定性和溶解性,與谷氨酸鈉按照一定的比例混合使用時,會有協同增效的作用。琥珀酸一鈉不僅具有鮮味,還具有酸味,其呈鮮味閾值是琥珀酸二鈉的1/2倍[30]。

2.5 有機堿

甜菜堿(Betaine)和氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide)是呈鮮味有機堿的代表物質。甜菜堿主要存在于甜菜糖的糖蜜中,具有強烈的吸濕功能,它能夠與谷氨酸鈉、琥珀酸等呈味物質共同作用使海產品呈現獨特的鮮味[31]。而氧化三甲胺兼具鮮味與甜味,常存在于水產品中,當水產品體內酶發生作用而分解氧化三甲胺,就會產生難聞的魚腥味[32]。

3 鮮味的呈味機理

3.1 鮮味受體

鮮味與其它基本味的感知途徑相似,由呈味物質刺激口腔味蕾上皮細胞中的味覺受體,通過味覺神經將信號傳導至大腦味覺中樞,再經過大腦綜合神經中樞的系統分析,最終產生味感[33]。到目前為止,還沒有關于鮮味感知的統一理論,但已發現兩種鮮味受體:異源二聚體T1R1/T1R3、味型代謝性谷氨酸受體mGluR4[34];它們都屬于G蛋白偶聯受體家族C亞族(C-GPCR)[35],胞外有類似捕蠅草形狀的結構域,具體由兩個部分組成:大的細胞外N-維納斯捕蠅草結構域(VFT)、由一個富含半胱氨酸的小結構域(CRD)連接的七跨膜結構域(TMD)[36]。有研究通過基因敲除實驗驗證了異源二聚體T1R1/T1R3是鮮味的主要受體,而mGluR4則為鮮味的候選受體。早期通過位點突變實驗,交換人源鮮味(T1R1/T1R3)和甜味受體(T1R2/T1R3)的VFT構建嵌合體模型,證明了人源T1R1 VFT是配體識別結構域[37],而且僅能夠感知L-Glu和5′-IMP。

3.2 呈味機理

當Glu與細胞膜表面的mGluR4受體結合位點結合時,便會產生信號,信號通過受體蛋白質傳遞,使得細胞膜上面向細胞內部一側的受體與g蛋白結合,這就表明食物中的鮮味信號已經被接收到,并且引發一系列的生物化學過程:某些離子通道打開,導致細胞膜上的電位下降,從而再次通過神經細胞向大腦發送脈沖信號[38]。

T1R1/T1R3受體的L-Glu結合位點位于T1R1部分,其分子結構與味型mGluR4受體相同,唯一的不同之處就是T1R1/T1R3對鮮度較弱的Asp并不敏感。雖然L-Glu只與受體的T1R1部分結合,但必須保證受體的T1R3部分也同樣完整并且和T1R3配對,整個受體系統才能正常工作,傳達鮮味信號。研究發現,與鮮味相關的T1R1/T1R3受體復合物對L-Glu的敏感性可以通過5′-IMP和5′-GMP來增強,這也是鮮味協同增效的原因。5′-IMP本身并不激活T1R1/T1R3,但可以與谷氨酸結合后來激活T1R1/T1R3[39]。

T1R1/T1R3的鮮味感知機理如圖1。鮮味受體T1R1/T1R3嵌入味蕾感覺細胞的細胞膜中。當VFT與L-Glu結合,便會發出信號,通過TMD結構傳導到細胞膜的內部,而此時,細胞膜內部一側便會有一個g蛋白被綁定。這些活動都發生在鮮味受體T1R1/T1R3的T1R1部分,當L-Glu在VFT彎曲的地方與其結合,會導致VFT的關閉,從而安全地捕獲L-Glu分子。另一方面,5′-IMP會附著在VFT邊緣的一個地方,增強VFT的捕獲能力,使得L-Glu分子與VFT結合地更加牢固,從而使T1R1/T1R3受體對L-Glu更加敏感。然而,如果沒有L-Glu,5′-IMP則不能單獨刺激鮮味受體T1R1/T1R3,這種效應被稱為變構效應[40]。近來有研究表明[41],表現在“捕蠅草結構”上的變構效應有一奇妙的動態特點:當“捕蠅草結構”沒有結合L-Glu時,它的動態幅度非常大;當有L-Glu分子與其結合時,它的動態幅度就會明顯放緩;而當5′-IMP也與其結合后,它的動態幅度就會變得非常緩慢。可以將鮮味受體T1R1/T1R3的“捕蠅草結構”形象化為“吃豆人”的形態(如圖2):當沒有L-Glu分子在吃豆人的喉嚨里時,他的嘴唇活動非常劇烈;當有L-Glu與他喉嚨結合時,嘴唇的運動減慢;當另外一個5′-IMP在他的嘴唇上結合時,嘴唇動態運動完全停止,他就沉默了。另外據研究推測[42],L-Glu與人源T1R1/T1R3的結合位點在T1R1的VFT鉸鏈區深處,而鮮味受體增強劑5′-IMP與VFT鉸鏈區的結合位點靠近VFT開口處,但具體結合位點尚無可知,亟待進一步探究。

圖1 T1R1/T1R3的鮮味感知機理Fig.1 Schematic illustration of the umami receptor T1Rl/T1R3

圖2 “捕蠅草結構”形象化為“吃豆人”的形態Fig.2 Comparison between the dynamic functioning ofthe Venus flytrap and Pac-Man

4 鮮味的測定

鮮味的檢測主要分為兩個方面,一方面是定性檢測,另一方面則是定量檢測。定性檢測通常用到的方法有感官評價法和電子舌檢測法,而定量方法多種多樣,不過多是采用儀器檢測代表性鮮味物質的含量后,通過滋味活性值(Taste Active Value,TAV)、味精當量(Equivalent Umami Concentration,EUC)等參數的計算來評價食品的鮮味。本文重點針對鮮味的定量檢測方法做以總結。

4.1 感官評價法

感官測試是評估食品味道的主要方法,在測試中,經過專門訓練的感官小組會對樣本進行評估,并根據感官感受評分判斷,最后經過統計分析數據對食品的味道、色澤、氣味等特點進行總結性評價和描述。

Suwankanit等[43]運用感官評價的方法,探究了老年消費者對添加天然成分和谷氨酸單鈉的熟肉制品的味道(尤其是鮮味)的接受程度和喜愛程度,結果發現添加了谷氨酸單鈉的樣品并沒有特別明顯地提高肉制品的鮮味。另外,用感官評價測定食品鮮度的這一方法通常與其他定量方法聯用。2016年,Gong等[44]運用感官評價和電子舌的方法對揚子江刀鱭進行了鮮味分析,研究了鮮味相關成分與鮮味之間的關系,通過遺漏測試和添加測試,找到了幾種對鮮味貢獻最大的幾種物質和離子——5′-GMP、5′-IMP、K+、Na+、Cl-和PO43+。

該方法操作相對簡單,整個實驗過程較為符合實際情況,不需要大型儀器。但由于感官評價者所處的環境和自身條件差異,評價結果存在客觀性和重現性差等缺點。

4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜又稱高壓液相色譜,是一種常用的柱層析分析技術,用于混合物各組分的分離、鑒定和定量。高效液相色譜可以用來檢測多種氨基酸、核苷酸,包括呈鮮味氨基酸與核苷酸。但由于大多是氨基酸并沒有紫外吸收和熒光發射特性,檢測器無法有效檢測,所以氨基酸需要經過衍生后才能運用液相檢測。

王平等[45]以2,4-二硝基氟苯為柱前衍生劑,運用高效液相色譜儀測定了谷氨酸棒桿菌發酵液中17種氨基酸的含量,這17種氨基酸的色譜圖分離效果較好且分析范圍廣,達到0.01～2.00 g/L,對于谷氨酸棒桿菌發酵液的理化性質分析提供了可靠的研究依據。劉登勇等[46]運用高效液相色譜測定了不同鹵煮次數的扒雞鹵湯中5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP等核苷酸的含量,探究了煮制新湯中核苷酸含量隨著煮制次數增加而呈現的變化規律,并探究出了一套檢測5′-核苷酸的色譜條件。

運用高效液相色譜檢測,分離效率較高,可以同時檢測多種鮮味氨基酸及核苷酸,且靈敏度高,儀器可以全自動檢測;但高效液相色譜儀價格高昂,且日常維護費用較高,檢測耗時很長。

4.3 氨基酸分析儀法

氨基酸分析儀常被應用于分析體液如尿液、血清、血液和食品樣品中的氨基酸含量,它是以各氨基酸的溶解度和吸光度不同為原理,對氨基酸進行分離和檢測。

Lin等[47]對郫縣豆瓣醬中的非揮發性有機酸和氨基酸進行了測定和研究,其中氨基酸的測定就是利用氨基酸自動分析儀來完成的,結果表明,郫縣豆瓣醬中含有7種常見有機酸和18種常見氨基酸,其中鮮味代表性氨基酸即L-Glu和Asp含量最高。周聰等[48]利用氨基酸分析儀測定了馴化種植的美味蘑菇中的氨基酸種類和含量,結果表明,鮮味氨基酸總量為5.4312 g/100 g,另外必須氨基酸占比較高,能夠充分證明這種蘑菇味道鮮美、營養價值很高。Sato等[49]對日本西南部沖繩縣不同性別的椰子蟹中的游離氨基酸、核苷酸相關化合物和脂肪酸進行了測定、分析和比較,其中對于游離氨基酸的檢測是通過氨基酸分析儀完成的。

氨基酸分析儀不僅能夠準確檢測出呈鮮味氨基酸的種類和含量,還能檢測其他各種類型的氨基酸,是如今較為常用的定量檢測氨基酸的方法,但是氨基酸分析儀對于樣品的純凈度要求較高,樣品預處理較為復雜,且氨基酸分析儀價格昂貴,保養維修成本高。

4.4 生物傳感器法

近年來,有人將人類味覺感受器與以納米材料為基礎的傳感器相結合制成生物傳感器,具有極佳的味覺測量性能。生物傳感器是以電化學工作站為檢測儀器,通過在工作電極上修飾酶制劑或者生物性物質來實現對特定物質的檢測。

2016年,Ahn等[50]開發出了一種含有味覺感受器的納米囊泡的雙電子舌(DBT)。以人胚胎腎293(HEK-293)細胞為基礎,通過基因的轉載表達培育能夠穩定表達味覺受體的細胞,再從這些細胞上分離出帶有鮮味受體T1R1/T1R3和甜味受體T1R2/T1R3的的納米囊泡,然后將這些納米囊泡固定于石墨烯表面,從而制成雙生物電子舌。雙電子舌可以同時檢測鮮味和甜味物質,可在低濃度(約100 nmol/L)下對目標試劑進行高度敏感和選擇性識別。此外,它還能夠像在人類味覺感官系統中一樣檢測到鮮味的協同增效作用。2018年,這個團隊又在之前實驗和研究的基礎上,開發出一種直接以鮮味受體T1R1/T1R3上的捕蠅草結構(VFT)為基礎的生物電子舌[51]。它顯示出很高的靈敏度,與人類味覺系統相似,可以連續5周保持90%以上的正常信號強度,具有批量生產、可重復使用、穩定性好等優點。

另外Huang等[52]在2018年將鮮味受體hT1R1安裝固定在玻碳電極表面,測量了四種呈鮮味物質(L-谷氨酸單鈉(MSG)、5′-IMP、5′-GMP和琥珀酸二鈉(SUC))的響應電流。采用傳感動力學方法計算了受體與配體相互作用的變構常數,結果表明,hT1R1對四種配體的感應能力為:GMP>MSG>IMP>SUC。發現hT1R1本質上是氮信號的識別受體,可能通過其氨基識別鮮味物質。本研究開發的新方法在信號轉導機制研究和藥物篩選方面具有廣闊的應用前景。才英明[53]運用氧化石墨烯與氯金酸、殼聚糖、上,組成工作電極,輔以Ag/AgCl電極作為參比電極、鉑絲電極作為對電極,運用循環伏安法對牛肉中谷氨酸含量進行檢測,結果表明,此法測得的結果與氨基酸分析儀法對谷氨酸的檢測結果相近,具有高特異性、靈敏性及可重復利用性。

4.5 電化學傳感器法

電化學傳感器是利用電化學反應原理,將無機或有機的化學物質固定在工作電極上,搭配以參比電極和對電極,記錄工作電極上的敏感物質與待測電解液的反應電流、電勢變化,這一系列變化就可以反應待測電解液中的某種物質的濃度。

2019年,朱靈濤[54]選擇N,N-二苯基硫脲(N,N′-Diphenylthiourea DPTU)作為鮮味敏感物質,研制了DPTU/PVC/PPy/Pt的膜修飾貴金屬傳感器。通過開路電位法對待測電解液中的Glu和Asp含量進行檢測,構建了開路電位值與呈鮮味氨基酸含量的數學模型,實現了對溶液中的Glu和Asp含量的準確檢測。

5 結語

本文以鮮味為出發點,介紹了不同食物中含有的不同鮮味物質,簡述了當前鮮味的提取方法,即傳統酵母提取法和現如今較為新穎的動物骨肉殘渣酶解、熱提取法。到目前為止,鮮味感知并沒有統一的分析理論,但已發現的鮮味受體包括異源二聚體 T1R1/T1R3 與味型代謝性谷氨酸受體mGluR4 兩種,其中T1R1/T1R3受體與L-Glu、5′-IMP的結合也解釋了鮮味的協同增效機制。另外,鮮味的檢測方法可分為兩大類:以感官評定和電子舌檢測為代表的定性檢測,以氨基酸分析儀、高效液相色譜儀等為代表的定量方法,本文對幾種常見的鮮味檢測方法做了簡要總結,并重點介紹了近幾年比較新穎的生物傳感器法和電化學檢測法,為鮮味的測定及食品風味的評價提供較為新穎的參考方法。

在進行鮮味物質檢測時,定性檢測結果較為宏觀,無法進行不同鮮味物質間的含量對比。而定量檢測中的常用方法多需使用昂貴的大型儀器,對于不同種鮮味物質的檢測方法有所差異,導致檢測時間較長。而現如今較為新穎的電化學及生物傳感器檢測方法既準確又省時,檢測不同鮮味物質的電化學和生物傳感器可以組成傳感器矩陣,能夠對各種鮮味物質進行同時、快速、準確檢測,這也是如今鮮味檢測領域亟需拓展的一個熱門領域和發展方向。