不同益生元對植物乳桿菌生長的影響

陳韞慧，方思璇，陳佳琪，郭振新，胡宇超，艾連中，王光強*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093)2(上海食品微生物工程技術研究中心，上海，200093)

益生元是一類不被宿主消化吸收卻能夠選擇性地促進體內有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機物質，目前常用的是功能性低聚糖，即由2～10個單糖分子所組成的寡糖類物質。益生元具有非消化的特性，但益生元可以被腸道菌群發酵，促進腸道益生菌的新陳代謝和繁殖[1-2]。益生元被分解代謝，通過產酸使腸道內pH值下降，減少機體內的毒素水平，提高機體的抗病性[3]。研究發現，益生元還能增強機體的免疫功能，調節脂肪、蛋白質、礦物質的代謝吸收，改善腸道的微環境系統[4]。雖然益生元十分重要，但目前益生元的篩選仍然比較混亂[3,5-6]。有的是直接在培養基中添加不同益生元后進行篩選，有的則是利用益生元代替培養基中的葡萄糖當作碳源。但到目前為止還沒有對這些方法進行比較，對不同培養條件下益生元對益生菌生長的影響還未知，而且這些結果是否與體外模擬腸道環境下的結果一致也需進一步的研究。另外，由于益生菌具有菌株差異性，不同菌株含有的糖類代謝基因完全不同，導致了益生元對不同益生菌的影響是不同的[7]。由于菌株之間的差異性很大，而且同一個糖類代謝酶可能可以作用于不同的寡糖類益生元，因此目前靶向篩選益生菌仍然是一個難題[3]。

本文分別在MRS培養基中添加益生元、以益生元替代MRS中的葡萄糖以及在體外模擬腸道中添加益生元為培養基，研究不同益生元對5株生理特性不同的植物乳桿菌生長的影響，提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

供試菌株：植物乳桿菌AR113、AR509、AR237、AR514、AR117,由本實驗室提供。

益生元：低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)純度≥95%、低聚木糖(xylooligosaccharides,XOS)純度≥95%、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)純度≥70%、低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharide,IMO)純度≥90%、菊粉(Inulin)純度≥90%，由上海源葉生物科技有限公司生產。

設備：Bioscreen C 全自動生長曲線分析儀，芬蘭 Bioscreen；HPX-9162MBE 型電熱恒溫培養箱，上海滬粵明科學儀器有限公司；湘儀L500臺式低速自動平衡離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海續暢實業有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，日本 Hirayama。

1.2 培養基配制

MRS培養基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、牛肉浸粉10 g、葡萄糖20 g、K2HPO42 g、CH3COONa·3H2O 5 g、檸檬酸三銨2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、吐溫-80 1 mL,定溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌20 min。

1.3 菌株純化

從-80 ℃冰箱中取出5株菌株，于MRS固體培養基上劃線后于厭氧培養箱培養48 h，重復3次后涂片，染色，鏡檢，然后用甘油保藏法保存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 添加益生元時植物乳桿菌生長曲線的測定

從-20 ℃冰箱中取出待試菌株，將5株菌株活化12 h后，以1%的接種量接種于MRS培養基中，分別添加20 g/L的FOS、XOS、GOS、IMO和Inulin，添加的益生元均經過0.22 μm水相過濾器過濾，對照組不添加益生元。每組取200 μL 菌液放置于全自動生長曲線分析儀的培養板中，37 ℃培養48 h，以未接菌的培養基為參比溶液，每組3個平行，測定間隔為0.5 h。

1.4.2 益生元充當碳源時植物乳桿菌生長曲線的測定

配制不含葡萄糖的MRS基礎培養基，以20 g/L的FOS、XOS、GOS、IMO和Inulin替換葡萄糖作為碳源，接種量為1%，對照組加入20 g/L葡萄糖，益生元與葡萄糖溶液都經0.22 μm水相過濾器過濾。每組取200 μL 菌液放置于全自動生長曲線分析儀的培養板中，37 ℃培養48 h，以未接菌的培養基為參比溶液，每組3個平行，測定間隔為0.5 h。

1.4.3 體外模擬小鼠腸道

由于腸道微生物所受影響因素很多，為了盡可能地控制飲食、環境等因素對腸道微生物的影響，也為了方便增加可重復性，依據文獻，采集統一喂養小鼠所排泄的糞便[8]。另一方面，隨著菌株特異性標記技術的成熟，后續進一步通過小鼠模型驗證體外所篩選益生元對特定益生菌的影響，從而確認此方法的可靠性。當然待小鼠實驗被證實完全可信后還需要增加人體相關實驗，證實有效后進而推廣產業化應用。

本實驗的具體操作如下：配制6 g/L的小鼠糞便溶液，均質后于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min。將活化12 h后的菌液以9 600 r/min離心1 min，倒去培養基，菌體洗滌后將1%菌液接種于小鼠糞便液體培養基中，加入20 g/L胰蛋白胨充當氮源，10 g/L益生元充當碳源(其分組如表1所示),對照組不添加胰蛋白胨與益生元，益生元與胰蛋白胨溶液都經0.22 μm水相過濾器過濾。每組取200 μL菌液放置于全自動生長曲線分析儀的培養板中37 ℃培養48 h，以未接菌的培養基為參比溶液，每組3個平行測定OD600，測定間隔為0.5 h。

表1 實驗分組Table 1 Test group

2 結果與分析

2.1 不同益生元對植物乳桿菌生長的促增殖作用

按照1.4.1小節所述方法添加相應益生元，利用Bioscreen測得各株植物乳桿菌的生長曲線如圖1所示。以OD600的最大值作為植物乳桿菌菌株的生長情況的代表量，將各組進行單因素方差分析，分析數據見表2和表3。由表2可知，與對照組相比，菌株的各益生元組的最大比生長速率均無顯著的增長跡象。由表3可知，除AR117的IMO組外，菌株在各益生元組的最大生物量與對照組相比無顯著的增長跡象。在一些組別中，添加益生元甚至顯著抑制了菌株的生長，如AR509、AR237的FOS組、XOS組、GOS組、Inulin組以及AR117的GOS組、Inulin組(P<0.05)。總體上添加益生元也不能促進它們的生長(P>0.05)。

目前大部分研究是在培養基中直接添加益生元，然后研究添加益生元后活性或者功能特性的變化[10-11]，部分研究把益生元添加到基礎培養基中[12]，但基礎培養基十分復雜，不適合大規模的篩選。但直接把益生元添加到MRS培養基中并不能促進菌株的生長，反而還可能抑制植物乳桿菌的生長。這可能的原因是葡萄糖效應，當益生元與葡萄糖同時存在時，菌株優先利用葡萄糖作為碳源，產生了分解代謝物阻遏效應[13-14]，但具體原因需要進一步的研究。因此有葡萄糖存在的情況下，直接添加益生元可能并不適合用作益生元的篩選。

圖1 植物乳桿菌在添加不同益生元的MRS培養基中的生長曲線Fig.1 Growth cur e of L.plantarum in MRS medium with different prebiotics

菌株最大生物量(OD600)對照FOSXOSGOSIMOInulinAR1131.546±0.005abc1.501±0.051c1.505±0.008bc1.570±0.020ab1.587±0.015a1.552±0.039abcAR5091.628±0.016a1.552±0.015bc1.571±0.028b1.551±0.019bc1.604±0.004ab1.516±0.040cAR2371.557±0.004a1.439±0.010c1.468±0.011b1.449±0.001bc1.561±0.009a1.469±0.021bAR5141.555±0.054ab1.528±0.011b1.532±0.011b1.544±0.022b1.609±0.006a1.514±0.031bAR1171.648±0.015b1.635±0.003bc1.654±0.012ab1.625±0.005c1.673±0.005a1.587±0.010d

2.2 植物乳桿菌在不同益生元作為碳源的培養基中的生長狀況

由于葡萄糖的存在影響了益生元的選擇，因此根據1.4.2的方法，用不同益生元替換MRS培養基中的葡萄糖，測得各株植物乳桿菌的生長曲線如圖2所示。由圖2、表4可知， AR113, AR509和AR117對益生元的利用情況相似，其增殖效果為：FOS、GOS最優，IMO次之，Inulin與XOS較差；益生元對AR237的增殖效果為：FOS、Inulin最優， IMO、GOS次之，XOS較差；益生元對AR514的增值效果為：Inulin>FOS> GOS>IMO>XOS。植物乳桿菌對不同的碳源具有選擇偏好性，且不同植物乳桿菌菌株具有菌株特異性，這與SHARMA等[15]的研究基本一致。總體上，FOS、GOS和Inulin對植物乳桿菌的增殖效果較好，而XOS的效果最差，XOS不適合用作植物乳桿菌的碳源。

圖2 使用益生元作為碳源時植物乳桿菌的生長曲線Fig.2 Growth cur e of L.plantarum using prebiotics as carbon source

菌株最大生物量(OD600)對照FOSXOSGOSIMOLnulinAR1131.563±0.013a1.441±0.044b0.556±0.024e1.413±0.012bc1.360±0.019c1.004±0.049dAR5091.660±0.028a1.504±0.014b0.570±0.013e1.501±0.024b1.370±0.013c0.784±0.023dAR2371.465±0.013b1.590±0.012a0.542±0.029d1.392±0.012c1.397±0.037c1.568±0.034aAR5141.529±0.029c1.573±0.029b0.536±0.010f1.343±0.016d1.276±0.003e1.620±0.009aAR1171.665±0.021a1.487±0.019b0.422±0.027f1.384±0.005c1.097±0.011d0.802±0.028e

根據各植物乳桿菌的最大比生長速率分析各菌株在不同益生元作為發酵底物時的活力，由表5可知,除XOS組，AR117中的GOS組、IMO組，AR237中的IMO組外，其余各組與對照組相比，最大比生長速率顯著提高(P<0.05)。其中，FOS、GOS與Inulin作為發酵底物時，菌株最大比生長速率提高幅度較大。這與上文中益生元增殖效果的分析相符合。

2.3 體外模擬小鼠腸道中植物乳桿菌對不同益生元的利用情況

糞便是胃腸道代謝系統的生理產物，可以間接反映腸道代謝情況。李俊等[16]通過代謝物總離子圖分析得知,小鼠糞便中含有多種小分子代謝物，如氨基酸類、脂肪酸、糖類、有機酸等。因此以滅菌小鼠糞便為培養基模擬小鼠腸道是可行的。與人工合成的其他培養基相比，小鼠糞便本身當作培養基更能反應小鼠腸道的環境[17]。為了驗證體外篩選的益生元能否在模擬小鼠腸道促進益生菌的生長，測得各株植物乳桿菌的生長曲線如圖3所示。

圖3 模擬腸道環境中各植物乳桿菌的最大生物量Fig.3 Maximum biomass of L.plantarum in simulated intestinal en ironment

可能由于營養成分的缺乏，5株植物乳桿菌在只含糞便培養基的對照組中均無明顯的生長現象。最近研究發現,氮源是限制腸道微生物生長的關鍵因素[18-19]。加入篩選的益生元與氮源后則出現了明顯的生長現象(圖3)。這表明植物乳桿菌在模擬腸道中可以利用FOS、GOS、Inulin這類益生元，促進自身的生長繁殖。通過比較植物乳桿菌的最大生長量可知，3株菌株AR113、AR509、AR117 對GOS與FOS的利用效率無顯著性差異，2株菌株AR514與AR237 中FOS的利用效率顯著高于Inulin(P<0.05)，Inulin在此模擬環境中不能很好地被植物乳桿菌利用，這說明在不同環境下植物乳桿菌利用益生元的種類不同，這可能是由于利用益生元相關的基因大部分是誘導表達的相關[20-21]，但具體原因還需要進一步的研究。

根據1.4.3小節的方法測得數據，通過軟件擬合后得到表6結果。由表6可知，除AR117以及AR113的GOS組外，各組的最大比生長速率均無顯著性差異，AR117與各組相比生長速率下降顯著(P<0.05)。比較各組植物乳桿菌生長的遲滯期可知，各植物乳桿菌的遲滯期差異較大，其中AR117的GOS組遲滯期最長，AR237的Inulin組遲滯期最短。這說明益生元對不同植物乳桿菌的影響具有菌株特異性。

表6 模擬腸道環境中各植物乳桿菌的遲滯期與最大比生長速率Table 6 Lag period and maximum specific growth rate of L. plantarum in simulated intestinal en ironment ±SD)

3 結論

在MRS培養下，添加5種質量濃度為20 g/L的益生元對植物乳桿菌無明顯促增殖作用，因此并不能用此方法篩選益生元。在以益生元替代葡萄糖作為碳源的MRS培養基中，植物乳桿菌對不同的益生元具有選擇偏好性，且具有菌株特異性。綜合5株植物乳桿菌在此培養條件下的生長狀況，低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉這3種益生元促增殖效果較好，此方法基本上能與模擬腸道的培養體系一致，但存在一定的誤差，比如菊粉在模擬腸道環境下不能很好地促進植物乳桿菌生長。在以滅菌小鼠糞便與胰蛋白胨復合為基礎培養條件的模擬腸道體系下，與對照相比，益生元能明顯促進所有植物乳桿菌的增長，其中低聚果糖與低聚半乳糖的促增殖效果更為優異，這是一個更加方便可靠的方法，可以用作益生元的篩選。