ε-聚賴氨酸對大腸桿菌的抑菌機制

王梓源，李欣穎，呂俊閣，付萍，孫雪文，李雪晶，譚之磊，賈士儒

(天津科技大學 生物工程學院,食品營養與安全國家重點實驗室，天津，300457)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)作為一種天然防腐劑具有廣譜抑菌性，已被廣泛應用于食品、醫藥、電子工業中[1]。但是目前國內對ε-PL的研究多集中于ε-PL高產菌株的選育[2-3]與應用[4-5]方面，對其詳細的抑菌機理了解有限，并且已有大部分報道是關于ε-PL對革蘭氏陽性菌和酵母的抑菌機制研究。LIN等[1]研究發現,ε-PL所帶正電荷可中和單增李斯特菌細胞表面的負電荷，增加細胞膜透性，從而破壞細胞膜結構。BO等[6-7]研究了ε-PL對釀酒酵母細胞的抑菌機理，發現抑菌和殺菌機制均與ε-PL濃度有關：當ε-PL濃度達到閾值濃度時，以氈毯模型的作用方式迅速作用于釀酒酵母細胞膜，使磷脂雙層彎曲穿孔，最終導致細胞死亡；當其濃度低于閾值水平時，可增加細胞膜通透性，改變細胞膜結構，破壞細胞膜功能，從而導致細胞內中心碳代謝被抑制。程雅文[8]發現，亞致死濃度的ε-PL可誘導釀酒酵母細胞中的活性氧迸發，使細胞進入凋亡早期階段；致死濃度的ε-PL能使細胞進入凋亡后期階段直至死亡。

而關于ε-PL對革蘭氏陰性菌的抑菌機理鮮少報道，大腸桿菌(Escherichiacoli)是人和多數動物體內常見的腸道共生革蘭氏陰性菌[9]，且廣泛存在于動植物產品中[10-11]，肉制品在加工過程中極易受到E.coli污染，從而引發食源性疾病[12]。不同的大腸桿菌菌株和不同生長狀態的同一菌株對ε-PL的耐受性不同。ZHANG等[13]研究了ε-PL對E.coliO157∶H7的抑菌作用，認為低劑量(質量濃度16 μg/mL)ε-PL能夠破壞O157∶H7細胞膜的完整性和通透性，從而起到抑菌作用。但對于某些大腸桿菌，此劑量的ε-PL并無抑菌效果，需要使用高劑量(質量濃度≥50 μg/mL)防腐劑[14]。E.coliTUST006是本課題組從腐敗食品中分離出的菌株，相比于其他E.coli在食品防腐領域中的應用更具研究價值。因此，本文以E.coliTUST006作為模式菌株，取處于對數生長期、生長旺盛的菌體為研究對象，通過抑菌實驗探究高劑量ε-PL對E.coliTUST006的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

E.coliTUST006(下文統一簡寫為E.coli)，天津科技大學生化工程研究室。

1.1.2 主要試劑

鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)(分析純)、N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, NPN)(分析純)，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母粉(分析純)，英國OXOID；胰蛋白胨(分析純)、NaCl(分析純)、NaOH(分析純)、戊二醇(色譜純)，天津市化學試劑一廠；ε-PL(純度≥ 99%)，浙江新銀象生物技術有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養基及相關溶液

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L和NaCl 10 g/L，5 mol/L的NaOH溶液調pH至7.0～7.2。LB固體培養基在液體培養基的基礎上加入1.0%～2.0%的瓊脂。所有培養基均121 ℃，1×105Pa滅菌20 min。

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)：KH2PO40.24 g/L，Na2HPO41.44 g/L，NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，濃HCl調pH至7.4。

PUM(phosphate-urea-magnesium)緩沖液：K2HPO4·3H2O 22.2 g/L，KH2PO47.26 g/L，MgSO40.2 g/L，尿素1.8 g/L，濃HCl調pH至7.1。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計(U mini-1240)，日本SHIMADZU公司；電導率儀(FE30)，瑞士METTLER TOLEDO公司；掃描電子顯微鏡(SU1510)，日本日立公司；激光粒徑測定儀(BI-90Plus)，美國BROOKHA EN儀器設備公司；熒光分光光度計(F-7000)，日本Hitachi公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 指示菌的活化

取一環斜面培養保存的E.coli接種于100 mL LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養12 h后，將培養液轉接到100 mL新鮮LB液體培養基中，使初始細胞密度OD600為0.02，37 ℃、180 r/min振蕩培養至OD600為0.2，備用。

1.3.2 抑菌曲線的測定

將不同質量濃度的ε-PL溶液分別加入到活化的E.coli菌液中，使ε-PL終質量濃度分別為0、50、100、150、200和250 μg/mL。繼續培養10 h，每間隔1 h測定E.coli細胞OD600值，取3次測量值的平均值繪制抑菌曲線。

1.3.3 細胞存活率的測定

將不同質量濃度的ε-PL溶液分別加到活化的E.coli菌液中，使ε-PL終質量濃度分別為0、50、100和150 μg/mL，繼續培養，并在2和4 h取一定量的菌液，采用稀釋涂布平板法，計算菌落數，每組設3個平行。按公式(1)計算E.coli細胞存活率:

(1)

1.3.4 ε-PL對E.coli細胞表面疏水性的影響

采用微生物黏著碳氫化合物法測定E.coli細胞的表面疏水性[15]。將E.coli培養至對數期，4 000 r/min離心5 min收集細胞，用PUM緩沖液洗滌并重懸，使菌懸液OD600值為0.5。取3 mL菌懸液分別加入等體積的質量濃度為100、200和300 μg/mL的ε-PL溶液，對照組加入3 mL PUM緩沖液，37 ℃水浴培養，在培養的第2和4 h取樣，首先測定菌液的OD600，再取3 mL上述菌液與400 μL十六烷混合，旋渦振蕩1 min，靜置15 min，取下層水相，用分光光度計測其OD600，每組實驗設3個平行。按公式(2)計算細菌表面疏水率:

(2)

1.3.5 ε-PL對E.coli菌懸液電導率的影響

取適量指示菌，參考KONG等[16]的方法并稍作改進，測定E.coli菌懸液的電導率值，從而確定金屬離子滲出變化趨勢。將E.coli培養至對數期，4 000 r/min離心5 min收集菌體細胞，用質量濃度為50 g/L的葡萄糖溶液洗滌并重懸。將上述菌懸液在沸水浴中處理5 min，測得的電導率計為σ0；分別將不同質量濃度的ε-PL溶液與等體積的質量濃度為50 g/L葡萄糖溶液或上述菌懸液混合，使ε-PL的終質量濃度為50、100和150 μg/mL，37 ℃水浴搖床培養，測得的電導率分別計為σ1、σ2。各組實驗設3個平行。按公式(3)計算混合體系的相對電導率:

(3)

1.3.6E.coli內膜通透性的測定

以ONPG為反應底物測定β-半乳糖苷酶活性變化，能夠反映ε-PL對E.coli內膜通透性的影響。使用含有20 g/L乳糖的LB培養基培養E.coli，4 000 r/min離心10 min收集細胞，重懸于5 g/L NaCl溶液中，使菌懸液OD600值為0.4，如未特殊說明，以下實驗所用菌懸液獲得方法均與上述相同。將1.5 mL不同質量濃度的ε-PL與1.5 mLE.coli菌懸液、150 μL 30 mmol/L ONPG溶液混合后，立即測定體系在420 nm波長處的吸光值。在第60、90和120 min各記錄1次數據，各組實驗設3個平行。

1.3.7E.coli外膜通透性的測定

采用NPN法測定ε-PL對E.coli細胞外膜通透性的影響[17]。分別取1.5 mL質量濃度為0、50、100和150 μg/mL的ε-PL溶液與20 μL 1 mmol/L的NPN溶液混合，用熒光分光光度計分別在激發波長350 nm、發射波長420 nm下檢測其熒光強度，然后在上述溶液中加入1.5 mL菌懸液再次檢測其熒光強度，直至熒光強度不再增加，2次所測熒光強度之差即為相對熒光強度，各組實驗設3個平行。

1.3.8 細菌菌體紫外吸收物的滲透檢測

分別取1.5 mL菌懸液加入等體積不同質量濃度的ε-PL，對照組加入等體積蒸餾水，使得ε-PL終質量濃度達到50、100和150 μg/mL。以加入ε-PL為起點，分別在培養的第2和4 h用紫外分光光度計測量菌懸液在260和280 nm波長處的吸光值，各組實驗設3個平行。

1.3.9 掃描電鏡觀察E.coli細胞形態

參考SHIMADA等[18]方法，將收集的菌體用9 g/L NaCl溶液洗滌，重懸于體積分數2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃冰箱靜置4 h。4 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀分別用體積分數30%、50%、70%和90%的乙醇進行梯度脫水5 min，最后用純乙醇重懸。取一定量適宜濃度的樣品滴加到蓋破片上，晾干。用導電膠將樣品粘貼在金屬樣品臺上，真空鍍膜，使用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察。

1.3.10 ε-PL對E.coli菌體聚集程度的分析

將E.coli培養至對數期，加入ε-PL溶液，使其終質量濃度分別為0、50、100和150 μg/mL，以加入ε-PL的時間為零點，分別在2和4 h取樣，使用粒徑分布儀測定菌體粒徑。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度的ε-PL對E. coli的抑菌曲線

由圖1可知，對照組E.coli在延滯期后，快速生長，而ε-PL可抑制E.coli生長，且這種作用呈濃度依賴性，抑制效果與ε-PL質量濃度呈正相關。質量濃度100 μg/mL的ε-PL就能夠有效抑制E.coli生長，至培養終點OD600約為對照組的一半，而ε-PL質量濃度≥150 μg/mL時，OD600幾乎沒有增長，實驗中的菌液也接近澄清，說明此時ε-PL幾乎能夠完全抑制E.coli生長。這表明ε-PL發揮抑菌作用需要一定的閾值濃度。

2.2 ε-PL對E. coli存活率的影響

由圖2可知，ε-PL可以明顯降低E.coli的存活率，且這種效果與ε-PL的質量濃度和作用時間呈正相關。經50 μg/mL ε-PL處理2 h后，E.coli的細胞存活率為47.98%，隨著時間延長，其存活率進一步降低；經100、150 μg/mL ε-PL處理2 h后，E.coli存活率分別下降至37.19%和14.88%，作用4 h后E.coli的細胞存活率分別為21.18%和5.61%，說明此時150 μg/mL ε-PL幾乎能夠完全抑制E.coli生長，此結論與抑菌曲線結果一致。

圖1 ε-PL對E. coli的抑菌曲線Fig.1 The time-kill cur e of ε-PL against E. coli

圖2 ε-PL對E. coli存活率的影響Fig.2 The effect of ε-PL on the sur i al rate of E. coli

2.3 ε-PL對E. coli細胞表面疏水性的影響

ε-PL對E.coli細胞表面疏水性的影響如圖3所示，與空白對照組相比，經ε-PL處理后，E.coli細胞表面疏水性明顯上升。質量濃度50、100和150 μg/mL的ε-PL作用2 h后，細胞疏水率分別為17.1%、20.3%和34.1%；作用4 h后，疏水率分別為11.4%、7.5%和23.5%。以上結果說明，ε-PL能夠明顯增大E.coli細胞表面疏水性。此細胞表面疏水性增大的現象與薄濤等[19]研究結果一致。這可能是因為E.coli表面疏水性與細胞壁中脂多糖含量密切相關，細胞壁中的脂多糖含量越低，E.coli細胞表面疏水性越強。而ε-PL帶有正電荷，可與E.coli外膜上帶負電荷的脂多糖通過靜電作用相結合，破壞脂多糖的結構，因此導致E.coli細胞表面疏水性增大。

2.4 ε-PL對E. coli菌懸液電導率的影響

當微生物細胞處于不利環境中，其生物膜流動性降低，半透性喪失，胞內的K+、Na+等電解質大量外泄，導致菌懸液體系電導率升高。因此，通過檢測菌懸液的電導率來推測細胞受損情況。結果如圖4所示，ε-PL處理后E.coli菌懸液的電導率明顯增大，特別是經150 μg/mL ε-PL處理4 h后，E.coli菌懸液的電導率遠高于未經處理的對照組。說明菌懸液電導率增大的現象隨著ε-PL質量濃度升高而愈發明顯。此現象與何靜如等[20]研究的(-)-β-蒎烯對沙門氏菌菌液電導率影響的結果較為類似。這可能是由于在ε-PL的作用下，E.coli細胞膜流動性降低，原生質外泄，導致E.coli胞內穩態被破壞，進而起到抑菌作用。

圖3 ε-PL對E. coli細胞表面疏水性的影響Fig.3 The effect of ε-PL on the cell surface hydrophobicity of E. coli

圖4 ε-PL對E. coli菌懸液電導率的影響Fig.4 The effect of ε-PL on the relati e conducti ity of E. coli suspension

2.5 ε-PL對E. coli內膜通透性的影響

當E.coli內膜遭到破壞時，其胞內β-半乳糖苷酶會透過細胞質膜泄漏出來，檢測β-半乳糖苷酶含量變化可以推測E.coli內膜通透性的變化[21]。如圖5所示，在ε-PL作用下，E.coli菌懸液在420 nm波長處的吸光值與對照組相比明顯增大，說明ε-PL作用下E.coli胞內β-半乳糖苷酶大量泄漏，即ε-PL能夠破壞E.coli細胞膜，最終導致E.coli生長受到抑制直至死亡。此結論與蔣佳佳等[21]研究的氧化石墨烯納米銀復合材料對E.coli細胞內膜的影響結果相似。

圖5 ε-PL對E. coli內膜透性的影響Fig.5 The effect of ε-PL on the inner membrane penetrating acti ity of E. coli

2.6 ε-PL對E. coli外膜透性的影響

菌懸液熒光強度與E.coli外膜被破壞程度呈正相關，如圖6所示，對照組菌懸液的熒光強度隨時間無明顯變化，一直維持在較低水平，而經不同質量濃度ε-PL處理后的實驗組菌懸液熒光吸收值，在20～40 min內迅速增加，在40 min后趨于平緩。并且，隨著ε-PL質量濃度升高，菌懸液的熒光強度進一步增加。說明ε-PL對E.coli細胞外膜具有破壞作用，且破壞作用與ε-PL質量濃度呈正相關。E.coli外膜滲透性也與脂多糖結構有著密切聯系[22]，因此，ε-PL對E.coli細胞外膜破壞作用的原因與ε-PL使E.coli細胞表面疏水性增大的原因是一致的，即ε-PL同E.coli表面的脂多糖通過靜電作用結合，改變或破壞E.coli的外膜結構，最終造成E.coli死亡。

圖6 ε-PL對E. coli外膜透性的影響Fig.6 The effect of ε-PL on the outer membrane penetrating acti ity of E. coli

2.7 細菌菌體紫外吸收物的滲透檢測

核酸、蛋白質等生物大分子貫穿于整個細胞膜和細胞質之中，是細胞的重要組成結構，E.coli細胞膜被破壞時，核酸、蛋白質等大分子物質就會泄漏到胞外[23]。據此，檢測菌懸液在260和280 nm波長處吸光度的變化，能夠了解細胞膜受損情況。由圖7和圖8可知，ε-PL可以促進E.coli核酸和胞內蛋白質釋放，該實驗結果進一步說明ε-PL能夠破壞E.coli細胞膜，進而導致菌體的死亡，與ε-PL對E.coli細胞表面疏水率、內外膜透性實驗結果一致。

圖7 ε-PL對E. coli胞內核酸滲漏的影響Fig.7 The effect of ε-PL on the leakage of intracellular nucleic acid of E. coli

圖8 ε-PL對E. coli胞內蛋白質滲漏的影響Fig.8 The effect of ε-PL on the leakage of intracellular protein of E. coli

2.8 SEM觀察結果

如圖9所示，未經ε-PL處理的E.coli細胞表面光滑、形態飽滿，未有細胞破損現象(圖9-a)。經50、100 μg/mL ε-PL處理2 h后E.coli細胞間出現明顯的聚團黏連現象，部分細胞表面出現凹陷，凸起(圖9-b和9-c)，且隨著ε-PL質量濃度升高，細胞表面變得粗糙皺縮、無飽滿感，細胞間聚團黏連明顯。上述質量濃度下的ε-PL處理4 h與2 h相比，細胞形態無明顯變化。而經150 μg/mL ε-PL處理2 h后，菌體表面出現大量微膠粒(圖9-d)，4 h后大部分菌體破裂塌陷，出現大量孔洞(圖9-h)，此時E.coli可能已喪失生存能力。此結論說明ε-PL具有破壞E.coli細胞結構的作用，與上述細胞膜疏水性及滲透性、紫外吸收物的滲透實驗結果一致。

目前，根據抗菌肽是否會對細胞膜的完整性造成損傷或能否進入細胞質中，將其分為細胞膜損傷機制和非膜損傷機制。在本研究中，SEM觀察結果表明，ε-PL抑菌活性是通過膜損傷機制實現的。在膜損傷機制中，關于桶板模型、環孔機制模型和氈毯模型的研究較為成熟[24]。在桶板模型中，抗菌肽是在不引起磷脂雙分子層彎曲的情況下直接插入細胞膜內，并通過抗菌肽分子間的疏水區域接觸細胞膜并與之作用[25]。而在環孔機制模型中抗菌肽雖然會使磷脂雙分子層彎曲，但不會產生微膠粒。氈毯模型中，抗菌肽通過靜電作用與磷脂分子中的陰離子頭部結合，像地毯般覆蓋在細胞膜表面，當抗菌肽的濃度達到一定程度后，細胞膜上會出現瞬時的孔洞，使得抗菌肽進入到細胞膜內，并且隨著磷脂雙分子層的彎曲及受損，細胞膜逐漸分解，與抗菌肽共同形成微膠團[26-28]。

a-0 μg/mL ε-PL處理2 h; b-50 μg/mL ε-PL處理2 h; c-100 μg/mL ε-PL處理2 h; d-150 μg/mL ε-PL處理2 h; e-0 μg/mL ε-PL處理4 h; f-50 μg/mL ε-PL處理4 h; g-100 μg/mL ε-PL處理4 h; h-150 μg/mL ε-PL處理4 h圖9 不同濃度ε-PL處理后E. coli的SEM圖Fig.9 The effect of ε-PL on the morphology of E. coli by SEM

在本研究中，經ε-PL處理后的E.coli形態出現不同程度的變化，可以明顯觀察到細胞表面粗糙、菌體出現孔隙和微膠粒以及磷脂雙分子層彎曲。因此，ε-PL對E.coli的抑菌作用可能是通過氈毯模型中所描述的機制實現的。

2.9 ε-PL對E. coli菌體聚集程度的影響

為進一步探究ε-PL處理后E.coli細胞間的黏連聚團現象，利用粒徑儀測定菌懸液的菌團粒徑。由圖10可知，未經ε-PL處理的E.coli菌團粒徑分布為0.5～1.5 μm(圖10-b)，與何國慶等[29]報道的E.coli菌體大小一致，說明菌體間相互均勻分散，幾乎未發生聚團。而經50、100和150 μg/mL ε-PL處理后E.coli的菌團粒徑分別為10～40 μm(圖10-c)、40～80 μm(圖10-d)和80～200 μm之間(圖10-e)，說明經ε-PL處理后E.coli菌團粒徑明顯大于未經ε-PL處理的對照組，并且其粒徑隨ε-PL質量濃度升高而增大，即ε-PL會使E.coli菌體發生團聚，該結果與SEM觀察結果一致。

a-不同質量濃度ε-PL對E. coli菌懸液粒徑的影響對比圖；b-0 μg/mL的ε-PL處理2 h；c-50 μg/mL的ε-PL處理2 h；d-100 μg/mL的ε-PL處理2 h；e-150 μg/mL的ε-PL處理2 h圖10 ε-PL對E.coli菌懸液粒徑的影響Fig.10 Effect of ε-PL on the particle size of E.coli suspension

HYLDGAARD等[30]研究表明，對ε-PL更耐受的E.colirscC突變體莢膜外多糖、莢膜異多糖酸的過量表達，有助于調節菌體生物膜的三維結構，并起到一定的屏障保護作用。可推測本研究中ε-PL作用后E.coli菌體發生團聚，可能是因為E.coli受到ε-PL刺激后分泌大量黏性多糖以抵御ε-PL的破壞作用。另一方面， AARA等[31]發現,ε-PL可吸附在革蘭氏陰性菌的細胞外膜上，破壞細胞膜結構，使膜脂多糖被釋放。所以本研究中引起菌體團聚的物質也有可能是E.coli細胞膜遭到ε-PL破壞后，釋放出來的脂多糖。此外，由于ε-PL是一種陽離子抗菌肽，本身帶有一定的正電荷，而E.coli帶有負電荷，因此,ε-PL還可能通過靜電吸附作用使E.coli菌體相互黏連，即ε-PL作為一種黏連劑將菌體黏連在一起。

3 結論

本文以E.coli為模式菌株，通過一系列抑菌實驗，揭示了ε-PL的抑菌機制。實驗結果表明，ε-PL對E.coli的抑菌活性具有劑量依賴性，與ε-PL的質量濃度呈正相關，當ε-PL質量濃度達到100 μg/mL時,有明顯抑菌效果。進一步研究表明，ε-PL能夠增強E.coli細胞表面的疏水性、內膜及外膜的通透性，并且改變E.coli細胞膜內外電勢，使得其細胞內容物如核酸、蛋白質等大量滲出。此外，SEM圖顯示ε-PL作用后E.coli細胞膜上出現孔洞、微膠團。上述結果說明ε-PL能夠破壞E.coli的細胞結構，從而達到抑菌效果。ε-PL對E.coli的作用類似于抗菌肽抑菌機制中的氈毯模型所描述的模式，即ε-PL首先通過靜電作用與細胞膜結合，鋪滿細胞膜表面，使E.coli細胞磷脂雙分子層彎曲受損，細胞膜逐漸分解，細胞內物質如電解質、胞內核酸與蛋白質釋放，進而導致菌體死亡。研究還發現，ε-PL處理后E.coli菌體會發生聚團黏連現象，且隨ε-PL質量濃度升高，細胞團聚愈發明顯。本文的研究結果對于ε-PL更好地應用于食品防腐領域具有一定指導價值，對ε-PL對其他微生物抑菌機制的研究也具有一定參考價值。