ATP生物熒光增幅法在微生物檢測中的可行性研究─應用于化妝品領域

翟磊，葛媛媛，洪海軍，劉吉泉，李婷，沈穎，林雅芳，蔡俊松，劉驥，劉瑞娜，王旭，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(聯合利華(中國)有限公司，上海，200335) 3 (Procter & Gamble International Operations，新加坡，138547) 4(北京寶潔技術有限公司，北京，101312)5(查士利華微生物應用技術(上海)有限公司，上海，201708)

近年來，我國化妝品質量顯著提升，據不完全統計，2015年至今我國化妝品市場抽檢合格率平均達到95%以上，但不合格產品中的微生物污染問題仍然存在并被社會重點關注[1-4]。《化妝品安全技術規范》[5](2015年版)(以下簡稱《規范》)將菌落總數、霉菌和酵母菌納入常規檢驗項目，檢測方法為平板計數法，該方法檢驗周期較長、使用人工計數，效率較低，目前已無法完全適應化妝品行業產能擴大、流通加速的迅猛發展需求[6]。當前微生物快速檢驗新興技術不斷涌現[7-10]，新方法開發、驗證、適用性評價及標準化應用成為微生物安全控制領域的研究熱點并取得顯著進展[11-14]。各國藥典和國際組織陸續頒布并不斷完善替代方法驗證相關指南。借鑒國內外食品和制藥等微生物檢驗領域的成功運用經驗，對我國化妝品微生物檢驗方法開展系統性研究[15]，將有力推動化妝品微生物檢測效率和過程控制水平提升，并在保障產品安全和消費者權益方面發揮重要作用。

本課題組前期基于ATP生物熒光技術[16-19]建立了一套適用于微生物快速檢測的ATP生物熒光增幅法，具有檢測速度快，準確度高的特點，可在48 h內實現樣品中細菌、霉菌和酵母菌的定性檢驗。該方法利用微生物體內的腺苷酸激酶AK，催化添加的二磷酸腺苷ADP轉換為三磷酸腺苷ATP，短時間內實現ATP增幅；通過添加熒光素酶和熒光素，將ATP高能鍵在斷裂過程中產生的能量轉化為生物熒光信號，通過計算生物熒光信號強度判斷樣品中是否含有微生物。為評價ATP生物熒光增幅法在化妝品微生物檢測中應用的可行性，本研究收集了與化妝品原料及其生產環境相關的47株代表性菌株，進行了富集培養基MTAT的促生長能力測試；選取了清潔類、護理類、美容修飾類6種化妝品，通過樣品影響測試和接菌試驗來評價化妝品產品的適用性，探究ATP生物熒光增幅法在化妝品及相關領域開展微生物快速篩選與檢測的應用前景。

1 儀器與材料

1.1 試驗儀器

Celsis?Ad ance II 光度計，Charles Ri er Laboratories；恒溫振蕩搖床THZ-98AB，上海一恒科學儀器有限公司；往復式搖床，EBERBACH；恒溫培養箱GHP-9270，上海一恒科學儀器有限公司；生物安全柜AC2-4S1，ESCO。

1.2 試驗菌株

通過文獻調研，結合微生物分類學特征和生長特性，本研究收集了與化妝品原料及其生產環境相關的47種細菌、霉菌和酵母菌代表菌株，用于促生長能力測試和產品適用性試驗，具體菌株信息見表1。

1.3 試驗樣品

根據化妝品分類標準[20]，選取了清潔類、護理類、美容修飾類6種化妝品，包括洗發水、沐浴液、護發素、定型水、面霜和面膜，每種產品選取3個不同生產批次。

1.4 試驗試劑

改良TAT(MTAT)培養基：TAT肉湯 22.50 g/L，硫代硫酸鈉 0.50 g/L、組氨酸 0.10 g/L、蛋白胨 7.50 g/L、葡萄糖 15.00 g/L、氯化鈉 0.85 g/L、卵磷脂1.43 g/L和吐溫80 39.00 g/L，pH 值調至7.0±0.1；ATP生物熒光增幅法試劑，Charles Ri er Laboratories Celsis?AMPiScreenTM；消泡劑，J.T.Baker?Antifoam B?Silicone Emulsion；0.5 mm玻璃珠，BioSpec Product。

2 實驗方法

2.1 促生長能力測試

將試驗收集的細菌和酵母菌制備成10～100 CFU/10 mL的菌懸液，霉菌制備10～100 CFU/10 mL的孢子懸液，接種到90 mL富集培養基MTAT，置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養24～48 h。在24或48 h取樣，使用ATP生物熒光增幅法對富集培養物進行上機檢測，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機檢測。同時，將細菌富集培養物接種于卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基，置于(36±1) ℃培養箱，培養(48±2) h；酵母菌和霉菌富集培養物接種于虎紅培養基，置于(28±2) ℃培養箱，培養5 d，確認接種物是否有微生物生長。

表1 促生長能力測試結果Table 1 Growth promotion test results

促生長能力測試通過的標準為，試驗收集的47株微生物菌株均能在富集培養基MTAT中生長良好，且ATP生物熒光增幅法檢測結果均為陽性。若促生長能力測試不能通過上述標準，需要對富集培養基的配方和培養條件進行優化。

2.2 產品適用性試驗

產品適用性試驗包括樣品影響測試和接菌試驗。化妝品產品在應用ATP生物熒光增幅法檢測前，應先進行產品適用性試驗來確定ATP生物熒光增幅法是否適用于待檢產品。本研究選擇大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CICC 10389、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC 10419、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10275、白色念珠菌(Candidaalbicans)CICC 1965和黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487用于產品適用性試驗研究。

2.2.1 樣品影響測試

樣品影響測試的目的是確保化妝品中的配方成分不會影響ATP生物熒光增幅法檢測，每種產品檢測3個不同生產批次。操作步驟為：將10～100 CFU試驗菌株接種于10 mL富集培養基MTAT中制備菌懸液 (黑曲霉制備孢子懸液)，同時將等量的菌液涂布于卵磷脂吐溫-80營養瓊脂培養基或虎紅培養基上確認實際接種量。稱取10 g產品，加至90 mL富集培養基MTAT中，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養基MTAT制備成產品樣品，同時將不接菌的富集培養基MTAT作為培養基空白。將上述制備的菌懸液、產品樣品和培養基空白置于(30±2) ℃搖床，200 r/min，振蕩培養48 h。取樣，對富集培養后的產品樣品進行上機檢測，并使用平板培養方法確認產品中是否含有微生物；取900 μL培養基加入100 μL ATP標品，制備成ATP對照；取900 μL培養基空白加入100 μL富集培養物的100倍稀釋液，制備成微生物對照；取900 μL產品樣品加入100 μL ATP陽性對照標品，制備為ATP樣品；取900 μL產品樣品加入100 μL富集培養物的100倍稀釋液，制備成微生物樣品。將上述制備的樣品和對照進行ATP生物熒光增幅法檢測，同時取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基或虎紅培養基上確認相應樣品中是否含有微生物。樣品影響測試結果的通過標準見表2。

表2 樣品影響測試通過標準Table 2 Success criteria for sample effect tests

2.2.2 接菌試驗

接菌試驗主要用于確認加入樣品中的防腐劑能否被富集培養基有效中和，每種產品檢測3個不同生產批次。操作步驟為：稱取10 g產品，加入90 mL富集培養基MTAT，充分振蕩混勻，取10 mL 1∶10稀釋液加到90 mL富集培養基MTAT制備成產品樣品，同時將不接菌的富集培養基MTAT作為培養基空白。將試驗菌株制備成10～100 CFU/100 μL的菌懸液(黑曲霉制備孢子懸液)備用，同時取100 μL涂布于卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基或虎紅培養基上以確認實際接種量。接種100 μL菌懸液或孢子懸液于產品樣品中制備成微生物樣品，同時接種100 μL菌懸液或孢子懸液于培養基空白中制備成微生物對照；將制備的產品樣品、培養基空白、微生物樣品和微生物對照置于(30±2) ℃搖床，200 r/min振蕩培養48 h。對富集培養后的樣品進行ATP生物熒光增幅法檢測，若樣品為霉菌，則需使用玻璃珠破壁處理30 min后再上機檢測。同時取100 μL富集液涂布于卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基或虎紅培養基上確認樣品中是否含有微生物。接菌試驗通過的標準為，微生物樣品和微生物對照的檢測結果為陽性，未接菌的產品樣品檢測結果應為陰性。

3 結果與分析

3.1 促生長能力測試

促生長能力測試結果見表1。本研究收集的47株微生物菌株在富集培養基MTAT中生長良好，ATP生物熒光增幅檢測結果均為陽性，并且在卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基或虎紅培養基上生長良好，表明富集培養基MTAT的促生長能力測試符合要求。

促生長能力測試主要考察MTAT培養基對菌株的富集培養能力，試驗菌株的選擇尤為關鍵。本研究結合微生物分類學特征和生長特性，選取與化妝品原料與生產環境相關的47種細菌、酵母和霉菌代表菌株，用于考察MTAT培養基的富集能力。從微生物分類特征上看，選取的菌株包括28株細菌(15株革蘭氏陰性細菌和13株革蘭氏陽性細菌)，5株酵母菌和14株霉菌，具有良好的代表性。從生理特性上看，既有生長速度快的代表菌株，又有對營養苛求、生長較為緩慢的代表菌種，如聚多曲霉(Aspergillussydowii)CICC 40930，繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)CICC 40279，宛氏擬青霉(Paecilomycesariotii)CICC 4025，拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailli)CICC 1281和樹脂枝孢霉(Cladosporiumresinae)CICC 41706，在富集培養基MTAT中培養48 h后，ATP生物熒光增幅檢測結果才為陽性。這5株真菌是生長緩慢的菌株的代表，為今后研究中生長緩慢代表菌株的選擇提供了重要的依據。

3.2 產品適用性試驗

3.2.1 樣品影響測試

樣品影響測試主要測試化妝品產品的本底信號值，確保化妝品配方成分不會影響ATP生物熒光增幅法的檢測。檢測結果見表3，培養基空白的信號值在167～285 RLU，遠低于檢測方法規定的 1 000 RLU，表明富集培養基MTAT本底信號符合要求。產品樣品的信號值在87～199 RLU，也遠低于3倍培養基空白信號值的要求，并且通過涂布平板確認化妝品樣品中未見微生物污染。此外，ATP對照、微生物對照、ATP樣品和微生物樣品的信號值均大于3 倍培養基空白的信號值，并且測試產品中ATP回收率在73.8%～106.8%，高于25%的標準推薦值，表明本研究選取的6種產品均通過樣品影響測試。

3.2.2 接菌試驗

接菌試驗主要是證明化妝品中的抑菌作用能否被富集培養基有效中和，檢測結果見表4。培養基空白的信號值在145～178 RLU，遠低于檢測方法規定的1 000 RLU，產品樣品的信號值在86～198 RLU，檢測結果為陰性，并且涂布平板確認化妝品樣品中未見微生物污染。而接種試驗菌懸液的微生物對照和微生物樣品，ATP生物熒光增幅法檢測結果均為陽性，并且通過平板確認微生物對照和微生物樣品中微生物生長良好，表明本研究選取的6種產品均通過接菌試驗。

綜合樣品影響測試和接菌試驗的檢測結果，ATP生物熒光增幅法適用于本研究所選洗發水、沐浴液、護發素、定型水、面霜和面膜中微生物的快速篩選與檢測，為后續該方法進行方法驗證和方法適用性研究奠定了基礎。

表3 樣品影響測試結果Table 3 Sample effect test results

表4 接菌試驗結果Table 4 Spiking test results

4 結論

本研究收集的與化妝品原料及其生產環境相關的47株代表性菌株，在富集培養基MTAT中生長良好，均通過了促生長能力測試；選取的清潔類、護理類、美容修飾類中6種化妝品均符合樣品影響測試和接菌試驗檢測方法的要求。因此，ATP生物熒光增幅法具有在化妝品及相關領域開展微生物快速篩選與檢測的良好應用前景。