基于特征肽段的液相色譜質譜聯用技術對核桃、杏仁露進行摻假鑒別

張淑霞， 田亞， 邢榮花，劉勝男， 王向軍*， 張守杰

1(鄭州海關技術中心，河南 鄭州，450002)2(安陽海關，河南 安陽，455000)3(三門峽海關技術中心，河南 三門峽，472000)

近年來，植物蛋白飲料已成為飲料市場的主流產品，越來越受消費者喜愛[1-2],隨著消費人群的快速增長，不法商販為了追求經濟利益，以次充好，摻雜摻假，如在核桃、杏仁露飲品中摻入價格較為低廉的大豆、花生成分[3]，這種商業欺詐行為不僅擾亂市場秩序，還侵犯了消費者的合法權益。因此，建立準確、可靠的植物蛋白飲料摻假的鑒定方法具有重要的現實意義。目前，植物蛋白飲料的摻假鑒別方法主要有酶聯免疫分析(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)和液相色譜質譜聯用技術。其中，ELISA技術的抗原抗體具有專一性，無法同時檢測幾種特異物種，且熱加工工藝易導致蛋白質沉淀和抗原決定簇的破壞，影響檢測結果的準確性[4-5]；PCR技術可實現多目標物同時檢測，是目前鑒定食品摻假成分的常用方法[6-9]，但是其檢測物DNA在高度加工過程中容易降解，且存在非特異性擴增引起DNA污染而導致假陽性結果的基質干擾問題[10-12]；液相色譜質譜聯用技術主要檢測蛋白質或不同物種的特征多肽，穩定性強、靈敏度高，可以實現多物種的同時測定，并且能夠避免復雜基質干擾及假陽性判別的問題。

隨著靶向蛋白質組學的發展，基于液相色譜串聯質譜技術的物種特征肽段檢測已逐漸成為食品摻假鑒別和外源性成分鑒定的主要方法[13-15]。古淑青等[16]采用液質聯用技術，鑒別出了羊肉、鴨肉、雞肉和豬肉4種肉類的生物標志性肽段，并建立了羊肉中摻入鴨肉、雞肉和豬肉的定量檢測方法。B?NICK等[17]利用液相色譜串聯質譜技術，對面包中的小麥、斯佩耳特小麥和黑麥的真實性進行了檢測。GU等[18]利用基于特征肽段的液相色譜質譜聯用技術,測定了巧克力中大豆、花生、杏仁、核桃、榛子等過敏源成分的含量。但是基于特征肽段的液質聯用技術定量測定核桃露和杏仁露中大豆、花生成分的研究還未見報道。

本文主要采用高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(high performance liquid chromatography coupled with quadrupole-exacti e mass spectrometr,HPLC-Q/Exactice-MS)和高效液相色譜-三重四級桿質譜(high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole tandem mass spectrometry,HPLC-QQQ-MS)相結合，篩選出核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段，并建立以特征肽段為檢測對象的核桃露和杏仁露摻假鑒別測定方法，為打擊植物蛋白飲料摻假行為、保證食品安全，提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜(HPLC-Q-Exacti e配Ultimate 3000液相色譜)、酶標儀，美國Thermo Fisher公司；液相色譜-三重四級桿質譜儀(Agilent 6470A配Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜)，美國Agilent公司；5427 R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；高溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；CF15RXII離心機，日本Hitachi公司；Y905制漿機，九陽股份有限公司；XS205天平，瑞士Mettler-Toledo公司；10 kDa超濾離心管，德國賽多利斯公司。

1.2 試劑與材料

測序級胰蛋白酶、二硫代蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)，生化級，美國Promega公司；碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)，生化級，美國Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸,均為色譜純,美國Thermo Fishe公司；Brad-ford蛋白定量試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；NH4HCO3、尿素為分析純；所有實驗用水由Milli-Q超純水系統制備，美國Millipore公司。

核桃、杏仁、大豆、花生均購于當地農貿市場，4個品牌共6個批次的核桃露、杏仁露和核桃杏仁露樣品購于當地大型超市。核桃露、杏仁露樣品制備：稱取去殼核桃仁、杏仁各7.000 g，加入240 mL 95 ℃熱水，用打漿機將其打碎，過200目篩，均質，殺菌備用。混合果露樣品制備:按以上制漿方法制備核桃大豆露、核桃花生露、杏仁大豆露及杏仁花生露，以核桃大豆露為例，大豆質量占堅果總質量(7.000 g)的10%、30%和50%。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白質提取

稱取10 g樣品，加入30 mL預冷乙腈混勻，于-20 ℃放置2 h,10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入5 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3),垂直振蕩30 min，溶解蛋白沉淀，10 000 r/min離心5 min, 上清液通過0.22 μm聚醚砜濾膜，一式3份，用Bradford試劑盒測定其蛋白質濃度。

對照樣品核桃、杏仁、大豆、花生于40 ℃鼓風干燥箱內干燥24 h，用粉碎機進行細粉碎。稱取1 g粉粹樣品加入10 mL正己烷振蕩3 min，10 000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復1次，去除脂肪。加入10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3)，步驟同上。

1.3.2 蛋白質酶解

取200 μL上清液轉移至1.5 mL離心管中，加入2 μL 1 mol/L的DTT溶液，60 ℃下反應1 h，冷卻至室溫后加入10 μL 1 mol/L的IAA溶液，常溫下避光反應30 min。采用10 kDa超濾離心管在13 200 r/min下離心超濾15 min，并用200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液置換3次，棄去下層溶液，加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液復溶膜上層蛋白，按酶和底物質量比1∶50加入胰蛋白酶溶液混勻，于37 ℃酶解16 h，加入2 μL甲酸終止反應，13 200 r/min離心10 min，下層獲得蛋白多肽樣品溶液，上機測定。

1.3.3 HPLC-Q/Exacti e-MS條件

色譜條件：PAK C18 MGIII色譜柱(2.0 mm×150 mm，3 μm)；柱溫45 ℃；流動相A為0.1%(體積分數)甲酸-水溶液；流動相B為0.1%(體積分數)甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～17 min，10% B～35% B；17～19 min，35% B～90% B；19～21 min，90% B～10% B；21～25.5 min，10% B。流速0.3 mL/min；進樣體積10 μL。

質譜條件：噴霧電壓3 500 ；毛細管溫度320 ℃；離子源加熱溫度250 ℃；鞘氣流量30 Arb，輔助氣流量10 Arb；質譜掃描模式Full MS-ddMS2(TopN)；全掃描分辨率70 000 FWHM；AGC target 3e6；進樣時間100 ms；二級掃描分辨率 17 500 FWHM；AGC target 2e5；進樣時間110 ms；碰撞能量30 e 。

1.3.4 HPLC-QQQ-MS條件

色譜條件：同1.3.3。

質譜條件：ESI源，采用正離子模式；毛細管電壓4 000 ，噴嘴電壓1 000 ，干燥氣溫度350 ℃，干燥器流速9 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，霧化器壓力30 psi。

2 結果與分析

2.1 高分辨質譜特異肽段的篩選

特征肽段指某一個蛋白質所特有的能夠將其與其他蛋白質特異性區分的肽段序列。特征肽段的篩選應遵循以下原則[19-20]：以7～20個氨基酸長度的肽為宜；不含錯切或漏切的酶切位點；避免出現天冬氨酸的水解、甲硫氨酸的氧化和谷氨酰胺的脫酰胺等不穩定肽段；選擇具有穩定的物理化學性質，有響應較強的碎片離子，進行定性定量分析時，有較好的靈敏度和峰形的肽段。本實驗采用HPLC-Q-Exacti e Full MS-ddMS2(TopN)模式分析胰蛋白酶酶解后的核桃、杏仁、大豆、花生多肽樣品，數據經Proteome Disco erer軟件和Uniprot蛋白數據庫對比分析，通過比較這4個物種鑒定的蛋白質和肽段列表，找到每個物種獨有的多肽信息，如表1所示。研究發現杏仁的GNLDF QPPR、 FSNDIL AALNTPR、大豆的EAFG NMQI R、LITLAIP NKPGR和TISSEDKPFNLR及花生的RPFYSNAPQEIFIQQGR因含有KR，KP，RP不適合做定量分析，為保證鑒定結果的重現性和靈敏度，在定量方法中未選擇其作為鑒定物種來源的特征肽段。

表1 核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段Table 1 Marker peptides of walnut, almond, soybean and peanut

二級質譜用于鑒定特征肽段的碎片離子，用來考察特征肽段碎片離子的檢測結果與理論推測的吻合性，多肽在電噴霧電離中主要產生N端碎片離子(b離子)和C端碎片離子(y離子)。以花生Ara h 3/4蛋白的特征肽段TANELNLLILR(m/z628.4)為例，如圖1所示，圖中灰色和淺灰色譜線分別代表理論b離子和y離子的碎片峰，黑色譜線代表實驗獲得的離子碎片峰，可以看出實驗獲得的譜圖和預測的碎裂模式匹配度很高，20個b、y碎片離子均得到鑒定。

圖1 花生特征肽段TANELNLLILR(m/z 628.4)的碎片離子排布實驗結果與理論對比圖Fig.1 Comparison of the experimental and theoretical prediction results for fragment ion arrangement of the precursor ion at m/z 628.4 assigned to the peanut marker peptide TANELNLLILR

2.2 三重四級桿質譜多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)模式分析

利用Skyline軟件在HPLC-QQQ-MS平臺上構建了特征肽段的MRM方法，優化碰撞能量(collision energy,CE)和碎裂電壓(fragmentor)，提高各特征肽段的響應強度。圖2為對大豆特征肽段LSAEFGSLR的490.3(2+)→779.4(+)離子通路施加不同fragmentor值和CE值得到的相應強度，可見當fragmentor為130 時,肽段響應強度最高。如此，針對每個離子對優化出了最佳的CE值和fragmentor值，生成最終的Dynamic MRM定量方法，MRM方法中各物種特征肽段離子對信息見表2，各物種特征肽段的提取離子色譜圖見圖3。

a-不同碰撞能量對照圖; b-不同碎裂電壓對照圖圖2 大豆特征肽段LSAEFGSLR的碰撞能量和碎裂電壓值優化結果Fig.2 Optimized results of CE and fragmentor alues of soybean marker peptide LSAEFGSLR

2.3 特異肽段的驗證

采用排除法驗證所選肽段的特異性，以大豆為例，將核桃、杏仁、花生特征肽段的MRM方法合并形成一個新的MRM方法，用該方法檢測大豆樣品，實驗結果如圖4-a所示，大豆樣品采集到的色譜質譜圖中沒有出現其他3個物種的特征肽段峰，出現個別肽段的單個離子對色譜峰的保留時間和對應肽段不相同，非目標肽段。采用相同方法驗證了花生、核桃和大豆樣品，結果如圖4-b、圖4-c、圖4-d所示，未出現保留時間和2個離子對符合的情況。由此可知,本方法篩選出的核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段間不存在相互干擾，確保了方法的專屬性。

2.4 方法學驗證

大豆、花生為核桃露和杏仁露中最常見的摻假成分，采用本方法對核桃露和杏仁露中摻入大豆和花生進行了定量檢測，即考察了核桃露中大豆和花生、杏仁露中大豆和花生的檢出限、回收率等性能參數。分別選擇響應較高的3個肽段進行方法學考察。

2.4.1 線性關系和檢測限考察

取系列標準溶液進樣，以峰面積為縱坐標，各特征肽段濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明各肽段組分在0.002 5～5 mg/mL線性關系良好。用核桃露和杏仁露酶解后的多肽混合溶液逐級稀釋大豆和花生酶解后的多肽混合溶液，同時用水逐級稀釋核桃露和杏仁露的酶解多肽溶液，按照方法進樣檢測，以信噪比為3計算各特征肽段的檢出限，并根據各物種的蛋白質濃度計算各特征肽段對應的大豆、花生在核桃和杏仁露中的檢出限，和核桃、杏仁成分在水溶液中的檢出限，結果如表3所示。

表2 核桃、杏仁、大豆、花生的特征肽段及MRM參數Table 2 Marker peptides and MRM parameters in walnut,almond,soybean and peanut

a-核桃; b-杏仁; c-大豆; d-花生圖3 核桃、杏仁、大豆、花生特征肽段的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the marker peptides for walnut,almond,soybean and peanut

2.4.2 方法的準確度和精密度

為了考察方法的準確性，即方法測定值與真實值之間的差異。按照1.2中的制漿方法制作含有大豆、花生的核桃露和杏仁露，按照前處理方法進行提取，上機測定飲料樣品中的大豆、花生成分含量，驗證該方法的準確度和精密度由。表4可知，除了花生的特征肽段AH Q DSNGDR在核桃露中的回收率為123.5%外，其他花生特征肽段的回收率均在71%～106%之間，且3次測定的RSD值均<16%(n=3)，大豆特征肽段的回收率均在69%～115%之間，3次測定的RSD值均<15%(n=3)，說明該方法有良好的抗干擾能力，能夠實現核桃露和杏仁露中大豆、花生成分的檢測。

a-大豆中核桃、杏仁和花生特征肽段的MRM提取離子流圖；b-花生中核桃、杏仁和大豆特征肽段的MRM提取離子流圖；c-杏仁中核桃、大豆和花生特征肽段的MRM提取離子流圖；d-核桃中杏仁、大豆和花生特征肽段的MRM提取離子流圖圖4 肽段特異性驗證結果Fig.4 erification results of peptide specificity

表3 核桃、杏仁、大豆、花生特征肽段的線性關系、線性方程、相關系數(r2)和檢出限Table 3 Linear range, linear equations, correlation coefficients(r2) and LODs of the marker peptides of walnut, almond, soybean and peanut

2.4.3 實際樣品檢測

以所建立的方法對市場上購買的4個品牌6個核桃露、杏仁露和核桃杏仁露樣品進行檢測，6個樣品中均檢出大豆和花生成分，其中1個核桃杏仁露復合蛋白飲料樣品中只檢測到了杏仁成分，未檢出核桃成分，可能是核桃投料過少，低于目前檢出限。

表4 大豆和花生6 個特征肽段的回收率和精密度Table 4 Reco eries and RSDs of the six marker peptides of soybean and peanut

3 結論

本研究采用HPLC-Q-Exacti e-MS和HPLC-QQQ-MS相結合，篩選出了核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段，并建立了以特征肽段為檢測對象的核桃露和杏仁露中植物源性成分的測定方法，該方法有較高的靈敏度和專屬性，可以同時測定多種植物源性成分，由于氨基酸序列在加工過程中比核酸序列更容易保存，因此利用液相色譜串聯質譜鑒別多肽在植物蛋白飲料摻假檢測中具有較大的技術優勢和重要的現實意義。