肝細胞生長因子受體蛋白表達及基因突變與胃癌臨床病理特征的關系

宗桂娟，尹海兵，李春筍，陳旭東，陶玉，楊磊，趙斌，何松

作者單位：南通市腫瘤醫院，a病理科，b腫瘤內科，江蘇 南通226361

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率逐年上升，嚴重危害人類健康［1］。目前，手術治療是早中期胃癌首選的治療方法，而晚期胃癌的治療則采用以化療聯合靶向治療為主的綜合治療。過去幾十年，隨著腫瘤生物學的快速發展以及腫瘤分子標志物的不斷涌現，使眾多靶向藥物應運而生，如表皮生長因子（EGFR）、肝細胞生長因子受體（c-Met）以及胰島素樣生長因子受體等［2］。c-Met蛋白是酪氨酸激酶受體超家族成員之一，由Met原癌基因編碼，是具有磷酸化活性的跨膜受體。它廣泛存在于各種細胞中，并對組織生長發育有著重要的生理調節作用［3］。c-Met與胃腸腫瘤（包括胃癌、結直腸癌、肝外膽管癌等）密切相關，在胃癌中表現為過度表達，但胃癌組織中c-Met 蛋白表達及基因突變的臨床意義鮮有報道［4］。本實驗選用c-Met單克隆抗體特異性地檢測胃癌組織中c-Met蛋白表達水平，將其與病人臨床病理參數進行相關性分析，分析c-Met基因突變與蛋白表達水平是否存在相關性。旨在探討胃癌發展過程中c-Met的蛋白表達及基因突變的臨床意義，為臨床個性化的診治提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月南通市腫瘤醫院住院的胃癌病人246 例。其中男181例，女65例。中位年齡66歲，年齡范圍為40～88歲。納入標準：無合并其他惡性腫瘤或者胃癌復發后再次手術者，臨床病理資料完整，術前未行放化療及其他抗腫瘤治療，手術病理診斷明確為胃癌。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要試劑與儀器 免疫組化所用抗體即用型試劑盒和一抗均購自Life technologies 公司；人組織基因組核酸提取試劑盒（貨號為DE02003）及核酸提取儀均來自上海科亦生物科技有限公司；DAKO Omnis全自動免疫組化染色儀；ABI9600PCR儀。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision（二步法）完成。c-Met 一抗工作濃度為1∶500，抗原修復方式為熱修復（Trish EDTA pH9.0）97 ℃，30 min。具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 免疫組化結果判讀 組織樣本來自胃癌病人手術切除的標本。c-Met的表達以細胞質（部分為細胞膜）呈棕黃色或棕褐色為陽性染色。每份標本置高倍鏡下選取5 個不同視野，每個視野計數200 個腫瘤細胞，由兩位病理醫師進行盲法判讀，計算陽性腫瘤細胞所占的百分數。結果分為4 級：未見明顯陽性細胞為“-”；陽性細胞數＜25%為“+”；25%～50%為“2+”；＞50%為“3+”；陽性標準定為2+或3+［5］。

1.5 熒光定量PCR 基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進行；本實驗所用引物為，正向5′-CAG GAT TGA TTG CTG GTG T-3′和反向5′-AAC AAT GTC ACA ACC CAC TG-3′；20 μL PCR 反應體系包括 10 μL 的 2×Expfu Mix、15 pmol 的上游引物、15 pmol的下游引物和3μL的樣品，加入PCR水體系補足至20μL；PCR程序如下：95 ℃預變性5 min，接著進行 35 個擴增循環：95 ℃ 10 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 15 s，隨后72 ℃ 5 min延伸。

1.6 統計學方法 應用SPSS 2.0 軟件進行數據處理及統計學分析，計數資料以例數或百分率表示，結果比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 c-Met 蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關系根據病人的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、有無淋巴結轉移、有無脈管侵犯等病理參數，將246例病人標本進行分組。統計學分析結果顯示c-Met 蛋白表達陽性率為83.3%，且與病人性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、有無淋巴結轉移無明顯關系（P＞0.05）；與脈管侵犯密切相關（P＜0.05）。各組c-Met蛋白表達情況見表1。

表1 C-met蛋白表達與胃癌臨床特征的相關性/例

2.2 不同年齡、性別、組織學分級胃癌c-Met 基因突變情況 基因檢測突變率為28%，通過分析發現c-Met 基因突變頻率在不同性別（P＝0.473）、年齡（P＝0.251）及組織學分級（P＝0.709）胃癌病人中無明顯差異。各組c-Met基因突變頻率見表2。

2.3 c-Met基因檢測與蛋白表達的相關性 基因檢測c-Met突變69例，其中35例免疫組化檢測結果為2+，3例免疫組化檢測結果為3+，即免疫組化結果與基因檢測結果相同者38例。根據χ2檢驗結果，c-Met基因檢測與蛋白表達的檢出率差異有統計學意義（χ2＝5.369，P＝0.021），兩者關聯性低，見表3。

3 討論

近年來分子靶向治療是胃癌治療研究的熱點，HGF/c-Met信號通路抑制劑作為治療胃癌潛在突破口，主要包括以下三種類型（1）抗HGF單克隆抗體，如 rilotumumab、ficlatuzumab 和 TAK-701［6］；（2）抗 c-Met 單克隆抗體，如 Onartuzumab/MetMAb［7］；（3）小分子酪氨酸酶抑制劑，主要阻止c-Met激酶的激活，如 PHA-6657520［8］。因此檢測胃癌組織中 c-Met 蛋白表達水平及基因突變情況，篩選潛在的受益病人，選擇合適的靶向治療方案，對指導臨床個體化治療尤為重要。c-Met作為原癌基因編碼的蛋白質，被稱為肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）特異性的細胞膜受體，兩種蛋白結合組成信號通路可以參與調控多種細胞的增殖、分化及運動改變［9］。在持續異常刺激后，使得HGF/c-Met 過度激活引發下游Ras/MAPK、PI3K/Akt 等信號通路激活，促進細胞分裂、誘導上皮細胞遷移和侵襲、促進細胞外基質降解等最終誘導細胞癌變［10］。因此研究c-Met 在胃癌發生發展中的作用及對胃癌靶向治療具有重要的臨床意義。

表2 胃癌病人中不同年齡、性別、組織學分級群體中c-Met基因的突變頻率/例（%）

表3 c-Met基因突變及c-Met蛋白表達分布/例（%）

研究表明在結腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中c-Met 過表達與病人不良預后呈正相關［11-12］。2016年谷光福等采用免疫組化分析129例胃癌病人臨床資料發現c-Met 陽性表達率為82.9%，且c-Met 蛋白過表達與腫瘤淋巴結轉移、TNM分期、OS、DFS顯著相關［13］。本研究結果顯示246 例胃癌組織中c-Met陽性表達率為83.3%，c-Met蛋白表達與病人性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移無明顯關系（P＞0.05）；但c-Met 蛋白過表達與脈管侵犯密切相關（P＜0.05），表明c-Met 過表達可以促進胃癌的侵襲。c-Met 基因突變率為28%，而c-Met 基因突變與性別、年齡及組織學分化均無明顯關系。

本實驗采用免疫組化法檢測c-Met 蛋白的陽性率為83.3%，且c-Met蛋白過表達僅與脈管侵犯密切相關，其中陽性率與國外相關研究的結果存在不一致［2，14-15］，主要原因除免疫組化檢測所用的抗體及方法有關外，還可能與免疫組化陽性判讀標準不一有關。此外，本研究結果顯示胃癌組織中c-Met 基因突變率較低，而c-Met 蛋白陽性率遠高于基因突變率，主要是由于基因表達是從DNA轉錄翻譯至蛋白質過程，其中蛋白質的形成過程既可以受轉錄調控也可以受外界調控因素的影響。因此c-Met的免疫組化結果不能替代基因檢測結果，對于考慮選用抗c-Met 單克隆抗體治療的病人，可以檢測c-Met 基因狀態。本組69 例c-Met 基因突變的胃癌組織中，38例c-Met蛋白過表達，提示免疫組化法檢測c-Met對篩查c-Met基因突變的胃癌病人并沒有甄別作用。

總之，c-Met 基因突變與c-Met 蛋白過表達具有不一致性。由于c-Met可能參與了胃癌的侵襲，因此檢測c-Met蛋白表達情況可以有助判斷病人的發展及預后情況。而檢測c-Met基因狀態對臨床指導選用抗c-Met單克隆抗體治療的胃癌病人尤為重要。