雞蛋中氟苯尼考殘留檢測的改進方法

杜楊，杜磊

（1.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，河南安陽 455000；2.安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽 455000）

氟苯尼考屬于氯霉素類（CAPs）［1］，包括氯霉素（CAP）及其衍生物，又稱酰胺醇類。氟苯尼考為動物專用的半合成酰胺醇類抗生素，其特點是抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣泛、注射或內(nèi)服均吸收良好［2］。氟苯尼考（FF）具有較強的免疫抑制作用［3］，并具有胚胎毒性［4］。隨著FF 在獸醫(yī)臨床的大量使用，其耐藥菌株也在不斷增加。

動物源性食品中CAPs 及其代謝產(chǎn)物的殘留檢測方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）、酶聯(lián)免疫法（ELISA），其中確證方法主要是質(zhì)譜法［5］。本試驗參照《GB/T 22338-2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》，提出相應(yīng)改進措施，在確保檢測結(jié)果準確與可靠的前提下，簡化前處理過程，縮短前處理時間，對提高雞蛋中氟苯尼考殘留檢測的工作效率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材 除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水。甲醇：色譜純，乙腈：色譜純，氨水，正己烷，乙酸乙酯，氟苯尼考標準品：純度≥99.0%；微孔濾頭（尼龍）：孔徑0.22 μm。

1.2 儀器設(shè)備 天平：感量0.01 g、0.000 01 g，高速冷凍離心機：≥8 000 r/min，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源，移液器：100 μL、1 000 μL，氮吹儀，均質(zhì)器，多管渦旋振蕩器。

1.3 儀器條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7 μm，2.1×100 mm）；柱溫：30 ℃；進樣量：2.00 μL；流動相：A乙腈，B水。

1.4 檢測方法

1.4.1 標準儲備液、中間液及工作液配制 標準儲備液（100 μg/mL）：準確稱取約10.0 mg 氟苯尼考標準物質(zhì)（精確到0.1 mg）于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100 μg/mL 標準儲備液（-20 ℃保存4個月）。

標準中間液（1 000 ng/mL）：準確移取標準儲備液（100 μg/mL）1 mL 于100 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成1 000 ng/mL 標準中間液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

標準工作液（5 ng/mL）：準確移取標準中間液（1 000 ng/mL）1 mL 于200 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成5 ng/mL 標準工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.4.2 提取 稱取樣品5 g（±0.01 g）置于50 mL離心管中，加標準工作液100 μL（100 ng/mL）、氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，渦旋振蕩10 min，8 000 r/min 離心5 min，將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至另一50 mL 離心管中。再加氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，渦旋振蕩10 min，8 000 r/min 離心5 min，合并上層液，55 ℃氮氣吹干。同時制作陽性對照樣品，在5 g（±0.01 g）空白樣品中加標準中間液100 μL（100 ng/mL），添加濃度為2.0 μg/kg（上機濃度為5 ng/mL）。

1.4.3 凈化 加正己烷2 mL 輕輕渦旋混勻，加20%甲醇2.0 mL 用手搖勻（注：若有乳化，取下清液于1.5 mL離心管中21 000 r/min離心；或者放入氮吹儀中加熱5 min），14 000 r/min 離心5 min，取下清液（用1 mL注射器吸取）過濾膜（若渾濁就再過一次）后供LC-MS/MS檢測。

1.4.4 定量方法 基質(zhì)單點，按外標法以峰面積計算，計算公式如下：

式中，A為供試溶液中氟苯尼考的峰面積；AS為標準品溶液氟苯尼考的峰面積；CS為標準溶液濃度（ng/mL）；V為定容體積（mL）；m為稱樣量（g）。

2 注意事項

蛋類有時會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，吸取的上清液體積往往少于加入的乙酸乙酯體積，如果提取一遍，用外標法校正時會導致回收率偏低，故可以重復提取一次，使得提取更加完全；脫脂時應(yīng)輕搖，避免用力過大造成乳化；高速冷凍離心的時候應(yīng)該選用質(zhì)量好的離心管，普通國產(chǎn)離心管在高速離心時可能會碎裂；過濾時用注射器小心吸取離心后的下清液，盡量避免吸到沉淀和上浮的雜質(zhì)，普通國產(chǎn)濾膜即可達到效果，個別渾濁的可用進口濾膜過濾。

3 結(jié)果分析

本方法依據(jù)《GB/T 22338-2008 動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》提出了較多的改進。國標中涉及的檢測對象為動物組織、肝腎、水產(chǎn)品及蜂蜜，沒有專門針對雞蛋的前處理方法。本次在國標方法的基礎(chǔ)上專門針對雞蛋給出了具體前處理方法。在提取過程中，國標方法用乙腈飽和正己烷、正丙醇、丙酮-正己烷等試劑多次提取轉(zhuǎn)移，相對于國標方法本試驗提取過程中僅用到了氨水、乙酸乙酯，提取過程簡易清晰，提取充分。國標方法的凈化過程要使用LC-Si 硅膠小柱、旋蒸儀、氮吹儀及丙酮正己烷淋洗、洗脫，而本改進方法中凈化過程不用硅膠小柱、旋蒸、氮吹，僅使用20%甲醇復溶和離心機。在同樣添加濃度為2.0 μg/kg 情況下，國標方法回收率在70%～90%之間，而本試驗方法回收率達到100%～110%，平行樣間結(jié)果相對標準偏差0.96%，實驗室間結(jié)果相對標準偏差5.4%，檢測限為0.1 μg/kg。

綜上，本次改進方法的前處理過程簡單、高效、準確，大大提高了工作效率；對人體有害的有機試劑使用較少；節(jié)省實驗耗材，減少前處理設(shè)備的使用。在社會效益與經(jīng)濟效益上具有不可估量的作用。