產S-腺苷蛋氨酸酵母菌的誘變選育

秦海彬，牛坤，王遠山*

1(浙江工業大學，浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室，浙江 杭州，310014) 2(生物轉化與生物凈化教育部工程研究中心(浙江工業大學)，浙江 杭州，310014)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)存在于各種生物組織內，具有廣泛的生物學功能[1]，參與體內蛋白質、核酸、多糖、磷脂以及脂肪酸等物質的生物合成[2-3]。SAM作為標準藥物的替代品對治療抑郁癥、骨關節炎、酒精性肝病和阿爾茲海默病具有相當大的優勢，市場需求巨大[4]。

SAM的生產方法主要有化學合成法、酶促轉化法和微生物發酵法，其中化學法合成產率低，反應底物L-半胱氨酸價格昂貴，且分離與純化過程困難，難以工業化應用[5]。酶促轉化法需要SAM合成酶并添加價格昂貴的底物ATP，因其生產投入較高而缺乏市場競爭力。發酵法生產SAM具有工藝流程簡單、產量高、底物廉價易得等優勢而被廣泛應用[6]。目前，已報道生產SAM的微生物主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)和釀酒酵母(Saccharomycescere isiae)。通過同源或異源過表達SAM合成酶可以提高大腸桿菌SAM產量，但是過多的SAM積累不利于菌體生長。重組畢赤酵母生產SAM需要甲醇作為誘導劑，可能引起安全問題，并且發酵周期長。與上述2種微生物相比，釀酒酵母作為安全生物廣泛應用于食品與發酵行業，且SAM合成能力強，適宜作為SAM工業生產的菌株[7]。

在傳統的產SAM菌株選育方面，SHIOZAKI等[8]篩選到1株野生釀酒酵母，在最適條件下通過發酵罐培養，SAM產量達到10.8 g/L，這是迄今在野生菌發酵產SAM方面最高的報道。利用化學誘變(NTG、EMS、LiCl等)、物理誘變(60Co γ-射線、U 等)以及復合誘變篩選SAM產菌株高也有較多報道，HUANG等[9]利用太空育種方法獲得釀酒酵母突變株H5M147，SAM產量達到1.22 g/L，是原始菌株的1.87倍。CAO等[10]用紫外連續誘變結合乙硫氨酸抗性篩選的方法，得到SAM高活性合成酶的釀酒酵母CGMCC2842，與出發菌株相比SAM產量增加了2.7倍，同時在15 L發酵罐中分批補料發酵36 h后SAM產量達到6.1 g/L。為獲得SAM高效生產菌株，本實驗擬采用常溫常壓等離體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和137Cs γ-射線誘變結合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板篩選，并通過搖瓶培養條件優化，5 L發酵罐分批補料發酵，為發酵法生產SAM奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要材料、試劑與儀器

Saccharomycescere isiaeZY由本實驗室保藏。SAM標準品、乙硫氨酸、制霉菌素、生物素、泛酸鈣、維生素B1、維生素B6,阿拉丁公司;其他試劑為國產分析純。

ARTP-II型等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Waters 1525高效液相色譜，美國WATERS公司；spectraMax M5酶標儀，美國分子儀器公司；5 L BIOTECH發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然。固體培養基再加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發酵培養基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 5，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，MgSO40.2，CaCl20.1，CuSO40.001 6，檸檬酸三鈉二水合物 0.1，pH自然，115 ℃滅菌30 min。

發酵罐發酵培養基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 3，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.6，MgSO43，CaCl20.5，CuSO40.001 6，鉬酸銨 0.004 8，NaCl 0.5，生物素 0.000 3，泛酸鈣 0.003 6，維生素B1 0.003 6，維生素B6 0.003 6。115 ℃滅菌30 min。

發酵罐流加培養基(g/L)：葡萄糖 500，酵母粉12。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

(1)菌種活化及種子培養。取菌種甘油管涂布于固體培養基平板，30 ℃培養2～3 d，挑取單菌落接入裝有10 mL種子培養基的試管中， 30 ℃，150 r/min培養12 h?；罨Y束后以2%的接種量接入裝有50 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃，150 r/min培養12 h。

(2)搖瓶發酵培養。250 mL搖瓶中裝液量為50 mL搖瓶發酵培養基，以4%(體積分數)的接種量接種，30 ℃，150 r/min搖床中培養24 h，補加2 mL 36 g/LL-蛋氨酸，繼續培養24 h。

(3)5 L發酵罐補料發酵

發酵罐裝液量為3 L，經過空消、實消滅菌后，種子培養基以10%(體積分數)接種到發酵罐中?？刂茰囟?、pH，罐壓調控在0.05 MPa，以200 r/min的攪拌速度開始發酵，發酵全程通過控制攪拌轉速與葡萄糖流加速度，使溶氧保持在10%～20%，最高轉速為750 r/min。發酵過程中每隔2～3 h取樣，測定還原糖、菌體量、SAM含量等參數。

1.2.2 誘變方法

(1)ARTP誘變。試驗工作氣體為氦氣，工作氣流量為8 SLM，處理距離為2 mm，電源輸出功率為120 W。將培養6～8 h的菌體適當稀釋后制備菌懸液，取5 μL菌液加5 μL 10%的甘油均勻涂于載片，80%～90%致死率劑量照射。照射后用無菌培養基清洗載片，洗液適當稀釋涂布篩選平板上，30 ℃恒溫培養箱中培養1～2 d，選擇較大單菌落進行發酵培養。

致死率/%=

(1)

(2)137Cs γ-射線誘變。在浙江省農業科學院輻照中心進行，將培養6～8 h的菌體適當稀釋后制備菌懸液，80%～90%致死率劑量照射。照射后的菌液經適當稀釋處理涂布篩選平板，30 ℃培養1～2 d，選擇較大單菌落進行發酵培養。

1.2.3 突變株篩選方法

(1)ARTP誘變與乙硫氨酸抗性平板篩選。蛋氨酸在SAM合成酶與ATP的作用下轉化為SAM，但在蛋氨酸類似物如乙硫氨酸的存在下該反應會被抑制，使用乙硫氨酸篩選高耐受突變株，有利于SAM產量的提高[11]。本實驗將ARTP照射后的菌液適當稀釋后涂布于0.4 mmol/L乙硫氨酸篩選平板，30 ℃培養1～2 d，選擇較大單菌落進行發酵培養。

(2)137Cs γ-射線誘變與制霉菌素抗性平板篩選。SAM是酵母菌合成麥角固醇的主要甲基供體且消耗量大，而制霉菌素能夠結合酵母菌細胞膜上的麥角固醇，導致麥角固醇產生途徑缺失，細胞膜通透性改變。理論上，制霉菌素可以用來選育高產SAM菌株[12]。將γ-射線照射后的菌液進行適當稀釋涂布于5 μg/mL制霉菌素篩選平板，30 ℃培養1～2 d，選擇較大單菌落進行發酵培養。

1.2.4 測定方法

(1)生物量測定。菌體干重(dry cell weight，DCW)的測定：烘干至恒重的離心管稱重(m1)，加入固定體積的發酵液，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用蒸餾水清洗后離心，重復2次。然后85 ℃烘干至恒重后稱重(m2)，m2-m1為菌體干重，經換算可得每升發酵液的菌體干重。

(2)SAM含量的測定。采用高效液相色譜法[13]。取1 mL發酵液，12 000 r/min高速離心2 min，棄上清液，加入200 μL超純水，200 μL乙酸乙酯，30 ℃金屬浴振蕩30 min，隨后加入500 μL 0.35 mol/L硫酸，振蕩1.5 h后12 000 r/min離心2 min，取上清液，0.22 μm有機膜過濾待測。

液相測定條件：色譜柱J&K C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相為40 mmol/L 磷酸二氫銨，2 mmol/L庚烷磺酸鈉和18%(體積分數)甲醇水溶液，檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min,進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

(3)葡萄糖含量測定。3,5-二硝基水楊酸法[4]。

2 結果與分析

2.1 高產菌株篩選

2.1.1 菌株ZY生長曲線與最佳照射劑量的確定

對釀酒酵母進行ARTP誘變時，一般使用對數生長中后期的菌體進行誘變，由于此時菌株酶活力高，生長旺盛且易發生突變[15]。每隔2 h取樣測600 nm吸光值(OD600)繪制菌株ZY生長曲線。由圖1可知，菌株對數期生長期在4～12 h，確定培養6～8 h的酵母細胞進行ARTP誘變與137Cs γ-射線誘變。經過照射時間和劑量的優化，發現ARTP照射180 s致死率在87.4%，由于誘變的致死率在80%～90%之間時，突變率相對較高，獲得優良性能菌株的可能性最大[16]，故實驗選擇ARTP誘變照射時間為180 s。取ARTP照射后的優勢菌株，進行γ-射線輻照，照射劑量700 GY時致死率在87%，故實驗選擇γ-射線誘變照射劑量為700 GY。

圖1 ZY菌株搖瓶生長曲線Fig.1 Growth cur e of strain ZY in shake flask fermentation

2.1.2 ARTP誘變育種結果

ARTP照射菌株ZY 180 s，培養后涂布于乙硫氨酸篩選平板，挑選相對較大的單菌落進行搖瓶發酵培養。經過5輪誘變，共獲得比出發菌株SAM產量高20% 的突變株23株。通過搖瓶復篩，突變株A-17的SAM產量最高，較出發菌株ZY提高了55.5%(表1)。因此，選擇突變株A-17為進一步誘變的出發菌株。

表1 ARTP誘變復篩結果Table 1 The rescreening results of ARTP mutagenesis

2.1.3137Cs γ-射線誘變育種結果

突變株A-17經700 GY γ-射線照射4輪，共獲得比出發菌株SAM產量高20% 的突變株11株。通過搖瓶復篩，突變株AC-4、AC-6和AC-10的SAM產量提升較高，其中突變株AC-10的SAM產量達到1.15 g/L，比突變株A-17提高了36.9%，比菌株ZY提高了130.0%(表2)。

表2 137Cs γ-射線誘變復篩結果Table 2 The rescreening results of 137Cs γ-mutagenesis

2.1.4 突變株遺傳穩定性

為考察突變株傳代后發酵水平穩定性，采用平板劃線方法傳代培養，將復篩的突變株AC-4、AC-6和AC-10各傳代10次。挑取偶數代檢測SAM含量，結果見圖2。與突變株AC-4和AC-6相比，突變株AC-10的SAM產量較高且能穩定遺傳，因此選作SAM的生產菌株。

圖2 突變株AC-4、AC-6和AC-10遺傳穩定性Fig.2 The inherit stability of mutant AC-4,AC-6 and AC-10

2.1.5 突變株AC-10搖瓶培養條件優化

2.1.5.1 培養溫度的確定

考查了24、27、30、33和36 ℃對突變株AC-10生長和SAM產量的影響。由圖3可知，溫度對菌體量無顯著影響，而對SAM產量有顯著影響。30 ℃時菌體量和SAM產量都達到最大，分別為7.19 g/L和1.16 g/L，當溫度繼續升高，SAM產量則降低。綜合SAM產量和菌體量，選擇30 ℃為最適培養溫度。

圖3 溫度對突變株AC-10生長和SAM生產的影響Fig.3 Effect of temperature on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.5.2 初始pH的確定

pH會對菌體細胞結構、參與代謝的各種酶活性力產生較大影響，間接影響菌體對培養基的利用，菌體的生長以及產物的生成[17]。在30 ℃下研究了不同初始pH值對突變株AC-10生長和SAM產量的影響。由圖4可知，初始pH由4.5提高到7.5的過程中，SAM產量和生物量變化顯著，且偏酸性環境有利于菌體生長和SAM生成，初始pH為5.5時菌體量及SAM產量達到最大值，分別為7.24 g/L和1.21 g/L。因此，選擇初始pH 5.5為最適pH。

圖4 初始pH對突變株AC-10生長和SAM生產的影響Fig.4 Effect of initial pH on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.6 突變株AC-10 5 L發酵罐分批補料發酵

在5 L發酵罐中溫度控制30 ℃，用氨水調節pH至5.5，以分批補料方式考查突變株AC-10產SAM的能力，其發酵曲線見圖5。整個發酵過程可分為適應期、快速生長期和轉化期3個階段。發酵前期，菌株生長緩慢，糖耗低，培養至15 h葡萄糖基本耗完，溶氧迅速升高，此時開始流加培養基，起始流加速度10 mL/h，其中葡萄糖流加濃度約為2.5 g/(L·h)。15 h后菌株生長迅速，糖耗高，通過調節流加速度，使罐內殘糖控制在5 g/L左右。配合轉速與通氣量調節，使溶氧保持在10%～20%。參考王杰鵬等[18]]蛋氨酸補加策略，當菌體量達到100 g/L時開始補加蛋氨酸。52 h時加入8 gL-蛋氨酸作為前體，此后每隔4 h補加一次。在L-蛋氨酸加入之前，胞內幾乎沒有SAM積累，在加入后則快速生成，在第68 h SAM產量達到5.62 g/L，最高產率為0.63 g/(L·h)。

圖5 AC-10突變株5 L發酵罐分批補料發酵曲線Fig.5 Time course of fed-batch fermentation by mutant AC-10

突變株AC-10在菌體量和SAM產量方面比原始菌株均有所提高，搖瓶中SAM最高產量為1.21 g/L，經5 L發酵罐分批補料發酵，SAM產量可達5.62 g/L，與HUANG等[9]、CAO等[10]報道的SAM產量基本持平。突變株AC-10在52～62 h最高SAM產率為0.63 g/(L·h)，但62 h后生長明顯停滯，原因可能是營養物質匱乏間接導致SAM產量降低。參考釀酒酵母發酵SAM的報道，如LI等[19]以突變株釀釀酒酵母CGMCC 13760利用豆腐黃漿液發酵SAM，在優化的工藝條件下，產量達到16.14 g/L;王杰鵬等[20]通過釀酒酵母SAM0801高密度發酵SAM，在優化的工藝條件下，SAM產量達到17.1 g/L;而LIU等[21]使用CRISPR工具整合外源基因獲得重組釀酒酵母HDL-R2菌株，通過蛋氨酸補加策略優化，SAM產量達到10.3 g/L。因此，突變株AC-10仍有進一步發掘的潛力，后續可通過發酵工藝優化達到高密度發酵、蛋氨酸添加策略優化或遺傳改造，進一步提高其SAM產量。

3 結論

針對S.cere isiaeZY發酵生產SAM產量低的問題，對其進行了5輪ARTP誘變和4輪137Csγ-射線輻照誘變，結合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板篩選，獲得1株遺傳穩定性較好的突變株AC-10，其SAM產量為1.15 g/L，與出發菌株ZY相比提高了130.0%。通過搖瓶培養條件優化，確定最適條件為30 ℃、初始pH 5.5，經5 L發酵罐分批補料發酵68 h后SAM產量達到5.62 g/L。結果表明,ARTP與137Csγ-射線突變率高，易獲得遺傳穩定性良好突變株，結合乙硫氨酸、制霉菌素抗性的理性化篩選育種，能夠提高篩選效率。本研究可為發酵法生產SAM奠定基礎。