優化碳源提升法夫酵母蝦青素產量和占類胡蘿卜素比例

孫新強，陳克杰，楊一恭，劉 燕，周旭燕，邵 東，徐作武，王小平

1(浙江昌海制藥有限公司，浙江 紹興，310032) 2(浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興，312500)

蝦青素 (astaxanthin)，3,3′-二羥基-β, β′-胡蘿卜素-4,4′-二酮，屬于酮式類胡蘿卜素，因其分子結構中紫羅酮環的3和3′位置各含一個手性 (或不對稱) 中心，故可形成3種對映異構體，即3S-3′S、3R-3′S和3R-3′R(也稱為左旋、內消旋和右旋)[1]。化學合成蝦青素為上述3種異構體的混合物。

法夫酵母 (Phaffiarhodozyma) 作為蝦青素的重要來源，其抽提物被證明具有安全性[2]，美國食品藥品監督管理局于2010年增補其用作動物飼料添加劑，亦于2013年進入中國農業部《飼料添加劑品種目錄》。基于蝦青素卓越的提高免疫、抵抗衰老和增加活力的功能，在美容、醫藥和養殖等領域呈現日益旺盛的市場需求和廣闊前景。受制于法夫酵母發酵生產蝦青素存在培養溫度低、產量低、碳源消耗大和耗氧水平高等問題，商業化進程受到嚴重阻礙，因此，學術界和產業界圍繞基因組特性[3]、菌株篩選[4-5]、代謝改造[6-7]、培養基優化[8-9]、促進因子篩選[10-12]、環境脅迫[13-16]和發酵過程控制[12, 17-18]等方面進行了全面研究。在法夫酵母發酵工藝方面，針對碳源的研究已相當廣泛。AN等[19]用含尿素和NaH2PO4的糖蜜作原料，在100 L中試規模發酵罐上最大生物量為36 g/L，類胡蘿卜素產量為40 mg/L；NGHIEM等[20]研究了5株法夫酵母對含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的玉米纖維水解糖的利用，發現利用阿拉伯糖時蝦青素產量最高，而高濃度的葡萄糖會抑制其他2種糖的利用；PAN等[21]在固定氮源濃度的條件下應用蛋白質組學方法研究了C/N對法夫酵母細胞生長和蝦青素積累的影響，得出蝦青素的產量與C/N呈負相關，隨C/N的增大而降低，比較蛋白組學研究則表明上述不同C/N條件下，涉及碳水化合物代謝和胡蘿卜素生成代謝的途徑發生較大變化；MIAO等[22]也報道了高糖濃度通過胡蘿卜素合成基因全局性調節因子creA，誘導胡蘿卜素合成基因crtE、pbs和ast的表達受到抑制。

基于上述法夫酵母發酵生產蝦青素過程中碳源占比高，碳源種類和濃度對菌體生理特性和蝦青素產量影響大的認識，本研究對實驗室保藏的1株具有商業化生產前景的法夫酵母進行碳源種類、組合對蝦青素產量和蝦青素占類胡蘿卜素比例的影響進行考察，確定了碳源控制工藝，并在10 m3發酵罐上進行中試放大，為本菌株商業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

PhaffiarhodozymaXC3015由上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司贈送，保藏于浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠生物藥物實驗中心。

1.1.2 試劑

蛋白胨、麥芽抽提物，英國OXOID公司；葡萄糖，西王藥業股份有限公司；麥芽糊精，山東西王糖業有限公司；糖蜜，濟南昌英達化工有限公司；乳酸，安徽豐原生物化學股份有限公司；(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O，江蘇紫東食品有限公司；酵母抽提物FM902，安琪酵母股份有限公司；麥芽糖漿，諸城市潤生淀粉有限公司；玉米淀粉，諸城興貿玉米開發有限公司；泡敵，江山宇軒科技有限公司；蝦青素標樣，Sigma-Aldrich (中國) 公司；α-淀粉酶，北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養基

固體培養基：YM培養基，成分參考文獻[23]，加入20 g/L瓊脂。

種子培養基：YM培養基。

發酵培養基 (g/L)：碳源 20.0、(NH4)2SO43.0、KH2PO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、CaCl2·2H2O 0.1、酵母抽提物 1.0、乳酸 5.0、泡敵 0.1。碳源指葡萄糖、麥芽糊精、可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖、糖蜜和玉米淀粉水解液中的一種或其組合。

發酵罐補糖培養基 (g/L)：70 L發酵罐為葡萄糖或/和麥芽糊精 400 (補糖培養基葡萄糖與麥芽糊精比例同基礎料葡萄糖與麥芽糊精比例，具體根據實驗設計)；10 m3發酵罐為葡萄糖 175、麥芽糊精 175、糖蜜 50。

種子、發酵培養基消前用2 mol/L NaOH溶液調pH值6.0。所有培養基碳源、氮源分消，滅菌條件為121 ℃，30 min。

1.3 儀器與設備

電子天平 (MS12001L/01型)，瑞士梅特勒-托利多公司；高效液相色譜儀 (1200型)，美國安捷倫科技有限公司；搖床 (Inno a 5000型)、離心機 (MiniSpin型)，Eppendorf公司；紫外可見分光 (U -2600A型)，尤尼柯 (上海) 儀器有限公司；小試種子罐 (BIOTECH-30 JS型)，上海保興生物設備工程有限公司；小試發酵罐 (LiFlus SP-70L型)，Biotron公司；中試種子罐 (1 000 L型)、中試發酵罐 (10 m3型)，江蘇遠方迪威爾設備科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養方法

平板培養：取冷凍甘油保藏液進行平板劃線，于20.5 ℃條件下培養5～7 d，長出較大菌落。

種子瓶培養：用接種環蘸取3～5個顏色較紅、菌落較大的單菌落，接種于種子培養基 (10 mL/50 mL試管)，于20.5℃、200 r/min條件下振蕩培養48 h。取2.5 mL上述試管培養液二次接種于種子培養基 (22.5 mL/250 mL三角瓶)，于20.5℃、200 r/min條件下振蕩培養36 h，獲得成熟種子瓶培養液。

發酵瓶培養：取二級成熟種子瓶培養液，按10%(體積分數)的比例接種于發酵培養基 (45 mL/500 mL三角瓶)，于20.5℃、200 r/min條件下振蕩培養120 h。

30 L種子罐培養：取二級成熟種子瓶培養液，按1.0%(體積分數)的比例接種于種子培養基 (20 L/30 L種子罐)，于溫度 (20.5±0.2) ℃、攪拌轉速350 r/min、通氣比1.5 m3/(m3·min)、罐壓0.06 MPa條件下培養40 h。

70 L發酵罐培養：將成熟種子罐培養液按10%(體積分數)的比例移種于發酵罐 (30 L/70 L發酵罐)，培養溫度(20.5±0.2)℃、通氣比0.6～1.5 m3/(m3·min)、罐壓0.06 MPa，全程用25%～28%氨水控制pH值為5.00±0.02，攪拌轉速與溶氧聯動，關聯值為40%。發酵過程中，當碳源質量濃度低于10 g/L時補加40%的碳源，維持碳源質量濃度為5～15 g/L之間。定期取樣測定菌體濃度、碳源濃度、類胡蘿卜素和蝦青素產量。

1 m3種子罐培養：1 m3種子罐0.5 m3計料，攪拌轉速200 r/min、通氣比1 m3/(m3·min)，其他條件同30 L種子罐培養。

10 m3發酵罐培養：10 m3發酵罐3.6 m3計料，起始攪拌轉速80 r/min，通氣比0.3～1.5 m3/(m3·min)，當溶氧低于20%時每次提高攪拌轉速10～20 r/min，控制溶氧水平在20%～60%，其他條件同70 L發酵罐培養。

1.4.2 測定方法

類胡蘿卜素檢測：采用分光光度法，參考文獻[24]。

蝦青素高效液相色譜法測定：參考文獻[25]。

菌體濃度檢測：對發酵液進行適當稀釋，測定波長600 nm處吸光度，根據光密度與細胞干重 (g/L) 的比值為(2.50±0.10)，確定細胞干重[23]。

總糖/還原糖檢測：按照菲林試劑法測定[26]。

1.4.3 淀粉水解液的制備

制備40%玉米淀粉漿，調pH值至6.20～6.40，加入0.2% CaCl2(按原料質量計算)，然后將α-淀粉酶加入淀粉漿中(用酶量6～8 U/g)，200 r/min攪拌，加熱至85～90 ℃，液化30 min。

1.5 數據處理

試驗均平行重復3次，試驗數據均以平均值±標準差形式表示，采用Origin Pro 8.5軟件進行數據處理、繪制試驗結果圖。

2 實驗與分析

2.1 大宗碳源種類對法夫酵母細胞生長及蝦青素合成的影響

以工業發酵常用的葡萄糖、麥芽糊精、可溶性淀粉、甘油、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖、糖蜜和玉米淀粉水解液作為碳源，在上述碳源質量濃度均為20 g/L的條件下，考察大宗碳源對法夫酵母細胞生長、蝦青素及類胡蘿卜素合成的影響，結果如圖1所示。

1-甘油;2-可溶性淀粉;3-麥芽糊精;4-蔗糖;5-葡糖糖;6-麥芽糖漿;7-乳糖;8-糖蜜;9-淀粉水解液圖1 不同碳源對法夫酵母生長及蝦青素合成的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the growth of P.rhodozyma and the production of astaxanthin

由圖1可知，不同碳源對法夫酵母細胞生長有顯著影響。考察的9種大宗碳源中，糖蜜、葡萄糖、麥芽糊精和麥芽糖漿更有利于法夫酵母細胞的生長。比較法夫酵母類胡蘿卜素的合成能力，所考察碳源按麥芽糊精、麥芽糖漿、淀粉水解液、蔗糖、甘油、葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜和乳糖的順序依次降低。由于不同碳源條件下蝦青素占類胡蘿卜素比例不同，因此蝦青素產量不完全與類胡蘿卜素含量成正比。蝦青素產量最高的碳源分別為麥芽糊精、淀粉水解液、麥芽糖漿，分別為 (53.7±0.9)、(43.7±4.3)、(41.0±1.2) μg/mL，較葡萄糖作碳源時的 (24.4±0.7) μg/mL分別提高120.0%、79.1%、68.0%。雖然，乳糖作碳源時蝦青素產量較低，但蝦青素占類胡蘿卜素比例最高，達到58.9%，而麥芽糊精、可溶性淀粉和淀粉水解液次之，最低的為蔗糖，蝦青素占類胡蘿卜素比例僅為24.6%。

2.2 碳源組合對法夫酵母細胞生長及蝦青素合成的影響

基于上述不同碳源影響法夫酵母細胞生長、蝦青素合成和蝦青素占類胡蘿卜素比例的認識，較優蝦青素占類胡蘿卜素比例前提下的蝦青素產量提升是產品收率提高的重要保證，因此，進一步考察了有利于細胞生長的碳源組合 (葡萄糖和糖蜜)和蝦青素占類胡蘿卜素比例提高的2類碳源組合的影響。參考相關報道[27]和單因素試驗，選取糖蜜質量濃度為5 g/L，依次與有利于蝦青素占類胡蘿卜素比例提高的碳源 (均為15 g/L) 組合，對應地，選取葡萄質量糖濃度亦為5 g/L，依次與有利于蝦青素占類胡蘿卜素比例提高的碳源 (均為15 g/L) 組合，進行發酵瓶實驗，結果如圖2所示。

1-糖蜜+葡萄糖;2-糖蜜+乳糖;3-糖蜜+麥芽糊精;4-糖蜜+可溶性淀粉;5-葡萄糖+乳糖;6-葡萄糖+麥芽糊精;7-葡萄糖+可溶性淀粉圖2 不同碳源組合對法夫酵母生長及蝦青素合成的影響Fig.2 Effects of different combinations of carbon sources on the growth of P.rhodozyma and the production of astaxanthin

糖蜜與葡萄糖、乳糖、麥芽糊精或可溶性淀粉組合時，菌體濃度均有不同程度的提高，且蝦青素產量分別為 (26.1±0.8)、(8.5±0.4)、(58.7±1.2)、(19.6±1.2) μg/mL，較后四者單獨作碳源時分別提高6.7%、62.4%、9.2%、20.7%，類胡蘿卜素產量則分別為 (83.3±2.2)、(17.6±1.0)、(134.3±3.0)、(48.7±1.5) μg/mL，分別提高15.4%、98.2%、22.8%、37.7%。雖然，糖蜜可以促進菌體生長及蝦青素、類胡蘿卜素的合成，但蝦青素占類胡蘿卜素的比例較葡萄糖、乳糖、麥芽糊精或可溶性淀粉單獨作碳源時降低，與糖蜜組合時該比例分別為31.3%、48.2%、43.7%、40.2%。葡萄糖與乳糖、麥芽糊精或可溶性淀粉組合時，蝦青素產量分別為 (15.0±0.3)、(55.1±0.8)、(23.9±0.9) μg/mL，較后三者單獨作碳源時分別提高186.0%、2.5%、47.0%，類胡蘿卜素產量則分別為 (32.9±1.0)、(130.5±1.4)、(59.2±1.4) μg/mL，分別提高269.6%、19.3%、67.3%。葡萄糖與乳糖、麥芽糊精或可溶性淀粉組合，生長及生產特性表現出所組合糖的綜合特性，其蝦青素占類胡蘿卜素比例分別為45.6%、42.2%、40.3%。因此，所考察組合中麥芽糊精與糖蜜或葡萄糖的組合產量最高，且蝦青素占類胡蘿卜素比例達到40%以上。

2.3 70 L發酵罐碳源混合補加提高蝦青素產量

雖然，糖蜜或葡萄糖與麥芽糊精為較佳的碳源組合，但受制于三角瓶在環境參數控制 (如溶氧水平與pH值)、補料流加控制 (如碳源和氨水) 等方面存在不足，進而引起發酵罐及三角瓶規模菌體生長及產物合成特性具有較大的差異，因此有必要在發酵小試罐上考察混合碳源補加工藝。設置發酵基礎料中糖蜜質量濃度均為5 g/L，葡萄糖或/和麥芽糊精總質量濃度為15 g/L，考察不同比例葡萄糖和麥芽糊精在70 L發酵罐上的影響，結果如表1所示。

表1 70 L發酵罐上葡萄糖與麥芽糊精比例對法夫酵母生產蝦青素的影響Table 1 Effects of glucose to maltodextrin ratio on the production of astaxanthin by P.rhodozyma in 70 L fermenter

由表1可知，在所有的碳源中，葡萄糖比例越高，有利于菌體生長。碳源的種類與比例影響蝦青素占類胡蘿卜素比例，其值與葡萄糖含量成負相關，且以麥芽糊精單獨作碳源時達到最高，為44.6%。當在所考察組合中葡萄糖和麥芽糊精比例為1∶1時，蝦青素和類胡蘿卜素產量最高，分別為(341.0±7.2)、(850.0±20.3) μg/mL，葡萄糖或麥芽糊精比例過高時，均不利于蝦青素生產或細胞增殖。

2.4 10 m3發酵罐中試放大研究

在70 L小試發酵罐確定最適葡萄糖與麥芽糊精比例的基礎上，進一步開展中試10 m3發酵罐的工藝驗證和放大研究。在生產實踐中，通常較大體積的發酵罐具有更高的溶氧供給水平，換言之，能夠保證較高的菌體濃度生長需求，因此在補糖培養基中加入50 g/L糖蜜促進生長。10 m3發酵罐中試放大實驗結果如表2和圖3所示。

圖3 10 m3發酵罐中試放大實驗結果Fig.3 Results of pilot scale-up in 10 m3 fermenter

表2 10 m3發酵罐中試放大實驗結果Table 2 Results of pilot scale-up in 10 m3 fermenter

10 m3發酵罐工藝放大結果表明，法夫酵母發酵生產蝦青素的過程屬于部分生長偶聯型，對數生長期為13～68 h，蝦青素合成期為44 h之后，經過180 h的培養，細胞干重、蝦青素和類胡蘿卜素分別達到 (92.9±1.1) g/L、(360.3±0.8) μg/mL和 (853.2±20.2) μg/mL，與70 L小試發酵罐相比，分別提高11.2%、5.65%和0.35%，蝦青素占類胡蘿卜素比例以及干菌體蝦青素含量也分別達到42.2%和3.88 mg/(g細胞干重)。

3 討論

雖然，法夫酵母在工業化生產蝦青素方面顯示出巨大的商業吸引力，但其發酵過程中呈現的克勒勃屈利效應 (Crabtree effect)[28]和高糖對胡蘿卜素合成基因的抑制作用[22]提示碳源濃度尤其是葡萄糖濃度對蝦青素發酵的重要性。同時，不同碳源在分子構成、碳鏈長短、微量成分等方面不盡相同，造成以菌體生長速率、蝦青素產量和比例等為主要參數的發酵技術指標存在較大差異。朱明軍等[29]報道糖蜜有利于法夫酵母生長，木糖有利于蝦青素積累，采用木糖和糖蜜的混合碳源蝦青素產量達到1.9 mg/L。朱曉立等[27]進行了不同配比的糖蜜和淀粉糖混合碳源對法夫酵母生物量和蝦青素產量的影響，確定最佳比例為糖蜜占總糖的40%，此時生物量為8.61 g/L，蝦青素產量為7 338 μg/L。AN等[19]認為甜菜糖蜜中Na和P是限制性營養物質，以尿素和NaH2PO4強化糖蜜營養構成，中試規模類胡蘿卜素產量為40 mg/L。上述關于碳源種類和濃度的相關研究存在如下缺陷：1) 所考察碳源單價過高，用于商業生產不具成本優勢，如木糖單價是麥芽糊精和葡萄糖的7～8倍；2) 局限于從發酵層次的產量提高出發，未充分考慮蝦青素占類胡蘿卜素比例及其工藝控制；3) 菌株產量低，以停留在三角搖瓶水平為主，離商業化生產甚遠。

本研究在保證蝦青素占類胡蘿卜素比例較優的前提下進行碳源組合以提升蝦青素產量，所考察的碳源市場價集中在3～6元/kg，且大量可得。通過搖瓶水平篩選，發現含低分子、短碳鏈的糖蜜、葡萄糖、麥芽糊精和麥芽糖漿有利于細胞增殖，長碳鏈的可溶性淀粉以及乳糖、淀粉水解液、甘油和蔗糖對細胞生長效果相對稍差。從蝦青素占類胡蘿卜素的比例分析，以單糖或二糖為主要成分的碳源，如糖蜜、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖漿，蝦青素占類胡蘿卜素比例較低，而具有較高聚合度的麥芽糊精、可溶性淀粉和淀粉水解液以及細胞代謝較差的乳糖，蝦青素占類胡蘿卜素比例較高。碳源組合中引入葡萄糖或糖蜜雖然會導致蝦青素占類胡蘿卜素比例的下降，但在一定的糖蜜濃度下，通過控制較佳的葡萄糖和麥芽糊精比例，仍能實現高蝦青素比例、高生產強度和高菌體干重統一的目標。中試試驗中，在補糖培養基中加強有利于菌體生長的糖蜜比例，可充分發揮中試罐提供更強供氧水平的優勢，能進一步提升菌體干重和蝦青素產量。

本研究明確了法夫酵母可用于工業化生產的碳源種類、組合和比例，實現小試及中試規模蝦青素產量與比例的提高，具有商業化運用價值。目前，圍繞法夫酵母發酵控制，傾向于低糖發酵、兩階段補料控制[21-23]，因此后續除了對發酵培養基配方、環境因子進行控制外，更多地需要在補料方式、碳源控制水平進行優化，降低碳溢流，從而進一步提升高產菌株產量。