培土生金法對COPD小鼠骨骼肌線粒體能量代謝保護作用機制研究*

胡 濤，周曉蕓 ，薛 丹 ，張麗華

（1.廣州市第一人民醫院，廣州 510180；2.廣州醫科大學，廣州 511436）

香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒長期作用于肺部是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的發病機制之一，有害氣體可刺激細胞釋放大量活性氧（ROS），從而引起氧化/抗氧化失衡，加速COPD的進展，最終發展成為呼吸衰竭，具有較高的病死率，而骨骼肌能量代謝不足是呼吸衰竭的直接原因，目前臨床上面臨著治療挑戰。呼吸肌大部分屬于骨骼肌，對能量有著較高的需求和敏感性，而線粒體是“能量加工廠”，如果其結構或功能損傷可直接導致骨骼肌供能不足。中醫學認為COPD晚期的呼吸衰竭屬于“喘證、氣脫”等范疇，其關鍵病機是“脾虛（痰）濕盛”。參苓白術散為培土生金的代表方，具有益氣健脾，祛濕化痰功效。臨床研究[1-2]發現參苓白術散可提高COPD患者運動耐力，減輕氧化損傷，但其相關作用機制目前尚不明確。故本實驗通過參苓白術散干予COPD小鼠模型，檢測腓腸肌組織三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和 一磷酸腺苷（AMP）及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）指標變化，探討培土生金法對COPD小鼠骨骼肌線粒體能量代謝的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級8周齡健康雄性SD小鼠50只（20±2）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（粵）2018-0094，本實驗得到廣東省中醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物的配制 參苓白術散（蓮子10 g，炒薏苡仁 10 g，砂仁 10 g，桔梗 10 g，炒白扁豆 15 g，茯苓20 g，黨參 20 g，炙甘草 20 g，白術 20 g，山藥 20 g），購自廣州市第一人民醫院中藥房，經廣州中醫藥大學中藥中心鑒定合格，用回流提取法將藥液濃縮至相當于藥液含2.25 g/mL生藥，4℃保存備用。

1.3 實驗藥品與試劑 大前門牌過濾嘴香煙（20 支/包，煙堿含量 0.8 mg，焦油量 11 mg/支，一氧化碳含量13 mg/支，上海煙草集團有限責任公司出品）；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）；RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供；兔抗小鼠AMPK、p-AMPK一抗（美國Cell Signaling Technology公司），兔抗小鼠PGC-1α一抗（美國Novus Biological公司），兔抗小鼠Mfn2單抗（英國Abcam公司）、β-actin單抗、山羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實驗儀器 自制熏煙染毒箱：70cm×50cm×40cm，145 L，每側各有1.5 cm×1.5 cm小孔；ODSHYPERSIL C18色譜柱（Thermo）；1260 高效液相色譜儀（Agilent）；NanoDrop 2000C超微量紫外/可見分光光度計（Thermo）；恒溫水浴槽（上海安寧醫療器械廠）；低溫臺式高速離心機（中國上海TLG16G）；電泳及轉膜裝置（美國Bio-RAD公司）。

1.5 COPD模型復制及藥物干預 小鼠在SPF級動物實驗室適應性飼養3 d后，采用隨機法將50只小鼠分為5組，分別為對照組（Control）、模型組（Model）、參苓白術散高、中、低劑量組（SL-H、SLM、SL-L），參照宋一平等[3]的方法制作小鼠COPD模型。除對照組小鼠，所有小鼠置入自制熏煙染毒箱，每天2批次予以被動吸煙，每批次8支大前門香煙，分兩次給予，每次持續30 min，2次熏煙間隔時間大于4 h，持續8周。熏煙完畢將動物放回原飼養籠中正常進食進水。熏煙4周后，在熏煙前給予藥物干預（SL-H、SL-M和SL-L分別按20、10、5 g/kg灌胃），對照組及模型組予生理鹽水灌胃。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 生存狀態 每日觀察各組小鼠的精神狀態、呼吸、攝食量、大便性狀及體質量變化等。

1.6.2 腓腸肌ATP、AMP及ADP含量檢測 精準稱取各組小鼠腓腸肌，置于冰上，制樣、檢測組織中ATP、AMP、ADP 含量[4]。

1.6.3 Western blotting法測定蛋白 AMPK、p-AMPK、PGC-1α及Mfn2 稱取各組肌肉組織，按照1 mg∶7.5 μL的比例將肌肉組織與RIPA裂解液混合置于冰上，用玻璃勻漿器進行研磨并裂解40 min，低溫離心機上離心半徑105 mm，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度后將樣本保存于-20℃冰箱。利用Western blot檢測各組小鼠腓腸肌組織 AMPK（1∶500）、p-AMPK（1∶500）、PGC1-α（1∶800）的表達變化，用試劑化學發光法顯色條帶，采用Sigma Scan Pro軟件進行數據分析，以β-actin作為內參標記各組蛋白表達水平，其中AMPK磷酸化程度則用pAMPK/AMPK比值表示。每組蛋白重復測量3次。

1.7 統計學方法 實驗數據采用SPSS 24.0統計軟件處理，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠生存狀態變化情況 各組小鼠熏煙時均喜聚集，多有流涎、點頭呼吸、喘促等癥狀，其中模型組喘促癥狀呈進行性加重，并伴有口鼻分泌物增多，喉中痰鳴，消瘦，大便稀軟，飲食及攝水量減少等。與對照組相比，各組小鼠體質量均增長緩慢，尤以模型組明顯，熏煙結束時體質量和前后差值體質量均有統計學意義（P＜0.05），而藥物干預組上述癥狀較模型組有所改善，但無統計學意義（P＞0.05）。各組小鼠體質量變化，見圖1。

2.2 參苓白術散對各組小鼠ATP/AMP和ADP/ATP的影響 與對照組比較，模型組ATP/AMP降低（P＜0.05）；ADP/ATP 無明顯趨勢，提示模型組小鼠腓腸肌存在著能量代謝障礙；與模型組相比，參苓白術散高劑量組 ATP/AMP 升高（P＜0.05），ADP/ATP無明顯趨勢，表明高劑量參苓白術散可改善骨骼肌能量不足狀態。見圖2。

2.3 參苓白術散對各組小鼠AMPK磷酸化水平與PGC-1α的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α 均下降（P＜0.05），提示腓腸肌組織磷酸化水平、調控能量代謝功能下降，而參苓白術散藥物干預后，肌肉組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α均增加（P＜0.05），提示參苓白術散可增加骨骼肌組織內的p-AMPK水平，誘導PGC-1α的表達，改善能量代謝，且存在著劑量效應，見圖3。

圖1 各組小鼠體質量變化情況Fig.1 Changes in body weight of mice in each group

2.4 參苓白術散對各組小鼠Mfn2蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內Mfn2表達降低（P＜0.05），提示腓腸肌組織線粒體穩態被破壞，能量代謝障礙，而參苓白術散藥物干預后，高劑量組Mfn2表達水平較模型組升高（P＜0.05），提示參苓白術散在線粒體層面保護COPD小鼠腓腸肌能量代謝，見圖4。

3 討論

中醫傳統理論認為“脾主肌肉，脾胃為氣血生化之源”，而宗氣是治療呼吸肌疲勞不可或缺的重要因素[5]，故健脾益氣（培土生金）可能為治療COPD骨骼肌疲勞的治則之一。相關研究表明[6-8]，健脾益氣中藥及健脾治則可改善動物骨骼肌疲勞，調控線粒體能量代謝。葡萄糖是機體內重要的能量物質，是維持機體活動的“原動力”，它主要是通過三羧酸循環等氧化分解代謝過程釋放ATP，而ATP可代謝為 ADP 和 AMP，ATP 含量、ADP/ATP、ATP/AMP[9-11]均與葡萄糖代謝相關。ATP/AMP反應的細胞內的能量變化，與AMPK的激活存在著關聯[12]，激活后的AMPK，一方面抑制消耗ATP的分解活動，另一方面通過線粒體生物合成等促進ATP的產生，從而恢復能量平衡[13]。本實驗研究發現，COPD模型組ATP/AMP比值降低（P＜0.05），提示腓腸肌能量存在著不足，可直接影響其功能狀態，而參苓白術散高劑量干預后，ATP/AMP 比值升高（P＜0.05），提示參苓白術散可改善COPD小鼠骨骼肌的能量供應，進而維持其正常發揮功能作用。

圖2 各組小鼠ATP/AMP和ADP/ATP的變化Fig.2 Changes in ATP/AMP and ADP/ATP of mice in each group

圖3 Western blot檢測參苓白術散對腓腸肌組織內AMPK磷酸化水平、PGC-1α的影響Fig.3 Effect of Shenling Baizhu Powder on AMPK phosphorylation level and PGC-1α in gastrocnemius muscle tissue detected by Western blot

圖4 Western blot檢測參苓白術散對腓腸肌組織內Mfn2表達水平的影響Fig.4 Effect of Shenling Baizhu Powder on the expression level of Mfn2 in gastrocnemius muscle tissue detected by Western blot

AMPK是機體內重要的調控因子，可感受細胞內能量變化，被激活后可進而調控下游各種蛋白激酶或基因表達，從而調控機體能量代謝。在線粒體保護方面，AMPK可首先激活PGC-1α，后者是促進線粒體生物合成的主要調節因子，在調節線粒體含量方面占有非常大的比重，可調節線粒體的數量和質量，調控能量合成，參與脂肪酸氧化過程，防止氧化應激損傷[14-17]。本實驗研究結果表明，與對照組比較，模型組小鼠腓腸肌組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α 均下降（P＜0.05），提示腓腸肌組織磷酸化水平、調控能量代謝功能下降，而參苓白術散藥物干預后，肌肉組織內p-AMPK/AMPK、PGC-1α增加（P＜0.05），提示參苓白術散可通過磷酸化AMPK改善COPD小鼠腓腸肌能量代謝障礙，此過程伴隨著PGC-1α表達的上調，表明參苓白術散可通過AMPKPGC-1α保護COPD小鼠骨骼肌功能狀態。

Mfn2是維持線粒體穩態的關鍵蛋白[18-19]，它處于線粒體外膜和肌漿網之間，主要介導線粒體之間的融合，從而促進物質交換。PGC-1α與雌激素相關受體共同調控著Mfn2[20-22]，PGC-1α表達下降及其本身乙酰化修飾后，Mfn2表達下調，線粒體穩態被破壞[23]，而導致能量產生障礙。本研究發現，模型組小鼠的Mfn2表達較對照組降低（P＜0.05），而參苓白術散干預后，Mfn2表達較模型組升高（P＜0.05），提示參苓白術散在線粒體層面影響到COPD小鼠腓腸肌能量代謝。

綜合本實驗結果，參苓白術散可能通過激活AMPK-PGC-1α-Mfn2參與保護COPD小鼠骨骼肌功線粒體生物合成及功能狀態，可提高p-AMPK、PGC-1α、Mfn2的表達，促進線粒體生物合成，進而增加ATP的生成。綜上所述，培土生金法（參苓白術散）在一定程度上可改善COPD小鼠骨骼肌能量代謝重構，從而起到保護COPD小鼠骨骼肌功能的作用。