強骨飲調節破骨細胞外泌體影響成骨細胞分化的初步研究

唐彬彬 劉康 吳連國 史曉林

浙江中醫藥大學附屬第二醫院骨科，浙江 杭州 310005

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種破骨細胞(osteoclast，OC)和成骨細胞(osteoblasts，OB)分化動態平衡失調的病理狀態。研究報道，OC來源的外泌體可通過傳遞micro-RNA(以下稱miRNA)至OB中抑制OB分化，進一步加重OP[1]。Wnt/β-catenin通路可促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)向OB方向分化，負責OB的增殖和分化，也可抑制OC分化，在骨生長和骨密度維持中具有重要調控作用[2-3]。miRNA與wnt/β-catenin通路關系密切，可調控OB分化增殖。中藥復方強骨飲治療原發性I型骨質疏松癥具有促進OB活性，增加骨量，抑制OC活性，減少骨吸收的多靶點特點[4-5]。基于以上研究，本研究擬初步研究強骨飲含藥血清改善破骨細胞外泌體影響成骨細胞分化的內在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12周齡清潔級雌性SD大鼠10只(批號：SYXK鄂，2018-0101)，體重在280～300 g。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1試劑：巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，PEPROTECH，315-02)，核因子κ B受體活化因子配體(RANKL，R&D，462-TR-010)，小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW 264.7，武漢普諾賽，CL-0190)，小鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSC，武漢普諾賽，CP-M131)，成骨誘導液(賽業生物，MUCMX-90021)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(TRAP，碧云天，P0332)，堿性磷酸酶測試盒(ALP，南京建成，A059-2)，外泌體抗體CD9(Abcam，ab92726)、CD63(Abcam，ab217345)、CD81(Abcam，ab109201)，β環狀蛋白(β-catenin，Abcam，ab16051)。

1.2.2儀器：倒置拍照顯微鏡(Leica，IX51)，垂直電泳槽(北京六一儀器廠，DYCZ-24DN)，水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-1)，磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器，T8-1)。

1.3 含藥血清制備

將大鼠隨機分為2組：對照血清組和含藥血清組。一副藥濃縮至22.2 mL(含生藥量245 g，包含防風15 g、黃芪30 g、忍冬藤25 g、露蜂房20 g、杜仲15 g、肉桂10 g、川芎20 g、川續斷30 g、骨碎補20 g、雞血藤25 g、秦艽15 g、鹿角霜20 g)，參考臨床成人用量換算成大鼠后的10倍劑量，并按體表面積換算，大鼠所需藥量為70 kg成人的6.3倍，即每千克大鼠每天灌胃劑量：245 g/70 kg×6.3×10=220.5 g/kg。大鼠灌胃劑量為20 mL/(kg·d)，每天灌胃兩次[每次灌胃量為10 mL/kg(含生藥量110.25 g)]，對照血清組采用生理鹽水灌胃，連續灌胃3 d，最后一次給藥后1～2 h采血(摘眼球取血，無菌操作)。分離血清，于56 ℃水浴滅活30 min，以0.22 μm濾器滅菌消毒，置于-20 ℃冰箱凍存備用。

1.4 構建OC和OB分化模型

構建OC模型采用M-CSF(20 ng/mL)、RANKL(50 ng/mL)處理RAW264.7細胞進行誘導；構建OB模型采用成骨誘導液處理的小鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSC)進行誘導。

1.5 實驗指標檢測方法

1.5.1OC模型TRAP染色。設1組為單純RAW264.7細胞，2組為OC模型加入對照血清，3組為OC模型加入含藥血清。對照血清和含藥血清另設2%、5%、10%、15%和20% 5種血清濃度，血清處理3 d。細胞誘導結束后，每孔(96孔板，每孔5 000個細胞)加入100 μL TRAP工作液，每組細胞37 ℃避光孵育10 min，棄掉染色液，顯微鏡拍照。

1.5.2OC來源外泌體提取。設1組為OC模型加入15%濃度對照血清；2組為OC模型加入15%濃度含藥血清。兩組以5×105/mL的細胞濃度接種于6孔培養板中，處理7 d后，去除上清液，更換新鮮培養基，24 h后收集兩實驗組外泌體，1組外泌體稱為Exo-Con，2組外泌體稱為Exo-Drug。

1.5.3外泌體表達及β-catenin蛋白檢測。采用免疫印跡試驗法(Western blot，WB)進行對CD9、CD63、CD81和β-catenin蛋白表達檢測。檢測β-catenin在總蛋白、細胞核中的含量，總蛋白以GAPDH為內參，細胞核以laminB為內參。細胞裂解后測定蛋白質濃度，并致于-80 ℃保存。將蛋白質轉膜至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。封閉液稀釋相應的一抗(GAPDH：1∶1000稀釋，CD9∶1∶1000稀釋，CD63∶1∶1000稀釋，CD81∶1∶1000稀釋，LaminB：1∶1500稀釋，β-catenin：1∶1500稀釋)，PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1∶5000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應數分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，顯影儀拍照。

圖1 RAW264.7細胞的TRAP染色 A：對照組，無任何處理；B：加入M-CSF和RANKL誘導破骨與不同濃度對照血清；C：加入M-CSF和RANKL誘導破骨與不同濃度含藥血清(**P<0.01)。Fig.1 TRAP staining of RAW264.7 cells. A: Control group, without any treatment; B: Adding M-CSF and RANKL to induce osteoclast and control serum with different concentrations; C: Adding M-CSF and RANKL to induce osteoclast and different concentrations of drug containing serum (**P< 0.01).

1.5.4ALP檢測。設1組為小鼠BM-MSC，2組為OB模型，3組為OB模型加入Exo-Con，4組為OB模型加入Exo-Drug。各組吸取培養液，離心取上清液備用；配制酚標準應用液。采用ALP試劑盒，空白管加入雙蒸水30 μL，標準管0.1 mg/mL酚標準應用液30 μL，測定管加入各組待測樣本30 μL，均加入緩沖液，基質液，充分混勻 37 ℃孵育15 min加入顯色劑，520 nm波長測定各孔吸光度。定義1 mL液體在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位。

1.5.5基因提取和基因表達檢測。收集OB模型細胞，預冷PBS清洗3次，1 500 r/min離心3 min收集細胞，以1×105/mL的細胞濃度接種于6孔培養板中。使用總RNA提取試劑盒提取RNA；提取的RNA進行mRNA逆轉錄程序，逆轉錄產物cDNA作為PCR擴增模板。RT-PCR反應程序：預變性，95 ℃，10 min；變性，95 ℃，15 s；退火，60 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s，40個循環。引物信息：成骨特異性轉錄因子(Runx2)：

F-5’-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3’，R-5’-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3’；

骨橋蛋白(OPN)：F-5’-CTTTCACTCC AATCGTCCCTAC-3’，R-5’-GCTCTCTTTGGAATGC TCAAGT-3’；

骨鈣素(OCN)：F-5’-AGCAGGAGGGCAA TAAGGTAGT-3’，R-5’-ACCGTAGATGCGTTTGTA GGC-3’；

內參抗體(Gapdh)：F-5’-GTATGACTCCA CTCACGGCAAA-3’，R-5’-GGTCTCGCTCCTGG AAGATG-3’。

1.5.6Wnt/β-catenin通路檢測：設1組為RAW264.7細胞；2組為OC模型加入15%對照血清；3組為OC模型加入15%含藥血清；4組為小鼠BM-MSC；5組為OB模型；6組為OB模型加入Exo-Con；7組為OB模型加入Exo-Drug。1～3組：M-CSF和RANKL處理4 d后，進行血清處理3 d；4～7組：誘導11 d時，加入外泌體，處理3 d。每組以1×105/mL的細胞濃度接種于6孔培養板中采用WB法檢測β-catenin，方法于1.5.3中說明。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件，計量數據用均值±標準差表達，采用t檢驗。計數資料采用Krusal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 強骨飲含藥血清對OC模型分化的影響

M-CSF和RANKL誘導處理增加OC模型的TRAP活性，促進破骨分化，而含藥血清可以抑制TRAP活性，抑制破骨分化。15%和20%的含藥濃度抑制破骨分化效果較佳(圖1)。

2.2 外泌體蛋白檢測

空白血清和含藥血清處理后的OC模型外泌體均表達CD9、CD63、CD81蛋白，表明外泌體提取和分離效果較好(圖2)。

圖2 RAW264.7細胞外泌體的蛋白檢測Fig.2 Protein detection of exosomes in RAW264.7 cells注：Exo-con為加入對照血清的OC外泌體；Exo-Drug為加入含藥血清的OC外泌體；CD9、CD63、CD81為外泌體抗體。

2.3 外泌體對OB模型ALP活性的影響

OB模型促進ALP活性增加，加入外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制ALP活性，但Exo-Drug對ALP抑制作用弱于Exo-Con。表明外泌體抑制OB分化，加入含藥血清降低對OB分化的抑制作用(圖3)。

圖3 BM-MSC細胞上清液中ALP活性檢測Fig.3 Detection of ALP activity in the supernatant of BM-MSC cells注：4組ALP表達兩兩比較差異均有統計學意義。

2.4 外泌體對OB模型成骨相關基因表達的影響

OB模型均能促進OCN、OPN、RUNX2基因轉錄，加入外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制OCN、OPN、RUNX2基因轉錄，但Exo-Drug對OCN、OPN、RUNX2基因轉錄抑制作用弱于Exo-Con。表明外泌體抑制OB分化，破骨分化誘導RAW264.7細胞外泌體抑制BM-MSC的成骨分化，加入含藥血清降低對OB分化的抑制作用(圖4)。

圖4 BM-MSC細胞成骨分化相關基因檢測 A：4組OCN表達檢測，兩兩比較差異均有統計學意義；B：4組RUNX2表達檢測，兩兩比較差異均有統計學意義；C：4組OPN表達檢測，加入對照血清和含藥血清OC外泌體表達無差異，其余比較差異均有統計學意義(**P<0.01)。Fig.4 Detection of osteogenic differentiation-related factors in BM-MSC cells. A: There were significant differences in the expression of OCN in 4 groups; B: Runx2 expression in 4 groups was statistically significant; C: There was no difference in the expression of OC exosomes in control serum and drug containing serum in group 4, and the other differences were statistically significant (**P<0.01).

2.5 強骨飲含藥血清對wnt/β-catenin通路的影響

M-CSF和RANKL誘導處理的OC模型抑制wnt/β-catenin通路(總蛋白和細胞核中含量減少)，而含藥血清則激活β-catenin通路(總蛋白和細胞核中含量增加)；OB模型激活wnt/β-catenin通路(總蛋白和細胞核中含量增加)，外泌體Exo-Con和Exo-Drug均抑制β-catenin通路，但Exo-Drug對β-catenin通路抑制作用弱于Exo-Con(圖5)。

圖5 RAW264.7與BM-MSC細胞內β-catenin蛋白檢測Fig.5 Detection of β-catenin in RAW264.7 and BM-MSC cells注：Total為細胞總蛋白內含量；nucleus為細胞核內含量；GAPDH與LaminB為內參蛋白。

3 討論

強骨飲為浙江省名中醫史曉林教授經驗方，已運用臨床10余年。在動物研究中證實，強骨飲可以有效增加骨量，促進鈣質沉積的作用[4-5]；臨床運用中，強骨飲在防治原發性I型骨質疏松癥、提高骨量、緩解疼痛等方面存在顯著療效。眾所周知，抑制OC分化和促進OB分化是治療OP的基本原則。臨床上大多采用骨吸收抑制劑治療原發性I型骨質疏松，而中醫藥防治OP具有多靶點的特點。本研究為探究中藥復方強骨飲的雙向調控機制，選擇觀察可聯系OC和OB的外泌體和wnt/β-catenin通路進行研究。

外泌體是一種細胞分泌的囊泡，內含組織或者細胞特異性蛋白、脂質和核酸片段，具有一定的細胞間信使作用，能通過水平轉移或細胞-受體相互作用來進行內容物的傳遞，調節其他細胞的功能，在疾病發生發展及診斷中起著重要作用[1，6]。2016年Nature Communication上報道，OC來源的外泌體可通過傳遞miR-214-3p至OB中抑制OB分化，OC miR-214-3p高表達的轉基因小鼠骨形成受到抑制[1]。肌細胞源性外泌體可通過miR-27a-3p增強成骨分化能力[6]。骨髓間充質干細胞來源的外泌體可促進成骨分化抑制OP[7]。礦化的OB外泌體通過miRNA抑制骨髓間充質干細胞Axin1表達激活wnt/β-catenin通路從而誘導成骨分化[8]。因此，OC外泌體在成骨分化過程中扮演重要角色，而強骨飲抑制OP是否與外泌體以及miRNA相關，則有待研究。

本研究首先對M-CSF和RANKL誘導處理的RAW264.7細胞構建OC模型，分別用強骨飲藥物和對照藥物進行干預。采用TRAP染色證實強骨飲可以抑制OC分化，找到最佳的含藥血清濃度。其次，使用最佳含藥血清濃度干預OC模型，進行OC來源外泌體檢測，發現實驗組和對照組均能提取外泌體，說明強骨飲對OC外泌體的釋放沒有影響。收集外泌體干預成骨誘導液的小鼠BM-MSC細胞，發現強骨飲干預下的OC外泌體作用于OB模型，相比于對照組，能緩解對BM-MSC細胞成骨分化的抑制作用。通過檢測ALP含量，OCN、OPN、RUNX2因子表達提供了證據。然而，相比于未加入外泌體的實驗組，OB分化未受到明顯抑制。本研究證實了OC模型外泌體影響OB分化，但強骨飲可改善這種影響。為了進一步探究干預機制，展開了對wnt/β-catenin通路的相關研究。

Wnt/β-catenin通路負責OB的增殖和分化[9]，可促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)向OB分化，抑制其向軟骨細胞或脂肪細胞分化，并抑制OB凋亡，從而促進骨形成[9]。研究報道，黃芪皂苷I(強骨飲君藥成分)可刺激成骨分化，且依賴于wnt/β-catenin通路[10]。印度黃檀異黃酮可激活BMP2-wnt/β-catenin通路誘導成骨分化促進骨生長緩解骨質疏松，該誘導作用可被wnt受體阻斷劑DKK1和TCF復合物抑制劑FH535所阻斷[11]。Wnt受體阻斷劑DKK1含量在卵巢切除的骨質疏松模型大鼠中顯著增加[3]，說明wnt/β-catenin通路也可抑制OC分化。研究發現強骨飲干預OC時，總蛋白和細胞核內β-catenin顯著增加，說明強骨飲可激活wnt/β-catenin通路來抑制OC分化；而在OB中，β-catenin含量受外泌體影響減少，但含藥血清可減弱對通路的抑制作用。表明了基于wnt/β-catenin通路強骨飲具有雙向調控的作用機制。

然而，對OC來源外泌體抑制OB分化如何影響wnt/β-catenin通路的內在聯系仍不明確，需要進一步研究。文獻報道，wnt/β-catenin與miRNA關系密切。miR-433-3p可靶向結合DKK1 mRNA UTR端，促進DKK1 mRNA降解，降低DKK1蛋白含量，從而促進成骨細胞分化[3]。miR-194通過抑制wnt負向調控子SUFU激活wnt/β-catenin通路[12]。miR-29c-3p通過靶向結合Dvl2 mRNA 3’UTR從而調節wnt/β-catenin通路調控成骨分化[13]。此外，miR-141、miR-22、miR-185等均可通過調節wnt/β-catenin通路影響成骨分化[14-15]。目前，中藥黃芪主要成分通過miRNA影響大鼠細胞癌變和心肌細胞缺血的研究已提示中藥與miRNA的關系[16-19]。進一步研究強骨飲與miRNA關系，為闡明強骨飲對wnt/β-catenin通路的調節機制具有創新性和可行性。

通過設置強骨飲含藥血清和對照血清進行細胞干預，初步證實了含藥血清可以抑制OC分化，能促進OC細胞內β-catenin蛋白的表達。同時，觀察到OC細胞可以釋放外泌體抑制成骨細胞分化，而強骨飲含藥血清可以改善破骨細胞外泌體的抑制作用。在堿性磷酸酶、相關成骨因子和β-catenin蛋白表達上得到了驗證。更重要的是，本研究假說上述變化可作用于wnt/β-catenin通路進行調節，這與外泌體傳遞miRNA作用相關靶基因有密切聯系。