GYY4137對去卵巢誘導的骨質疏松大鼠的實驗研究

王朝迅 王聰聰 賀艷菊 李秀財 谷成英 周里鋼

上海市浦東醫院 復旦大學附屬浦東醫院內分泌科，上海 201399

隨著許多國家人口老齡化的不斷增加，骨質疏松已成為一種較為常見的臨床診斷。骨質疏松常見于絕經后婦女，診斷通常為絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。骨質疏松最常見的治療方法之一是外源性激素替代療法。然而，這會增加生殖系統腫瘤的風險[1]。雙膦酸鹽長期使用可導致頜骨壞死和長骨不典型骨折[2]。重組甲狀腺激素(PTH)藥物已被證明能直接促進骨形成，但同時刺激破骨細胞生成，增加骨吸收[3]。因此，尋找新的治療方法具有重要的臨床意義。H2S作為一種還原劑，在生理濃度上具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用[4]。血漿內源性H2S濃度與衰老速度和氧化應激水平呈負相關[5]。目前普遍認為氧化應激在PMOP中起重要作用。一些研究證實外源性H2S通過ERK1/2依賴的抗氧化機制促進成骨細胞的形成和分化，成功地抑制了過氧化氫對成骨細胞株MC3T-E1的氧化損傷[6]。GYY4137是近幾年發展起來的一種新型硫化氫控釋劑，它緩慢而持續地在體內釋放H2S，極少有毒性。它能模擬內源性H2S的形成，作為外源供體具有優于硫化鈉的優勢[7]。本研究探討GYY4137對去卵巢誘導的骨質疏松大鼠模型的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和治療方案

80只6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠[(265±15)g，上海史萊克實驗動物]，將它們飼養在溫度為(23±2)℃，相對濕度為(55±10)%，并且常規12 h光照循環的房間中。由指定的人喂養，可以自由地吃喝。在進行骨質疏松癥模型之前使大鼠適應環境1周。

將80只大鼠隨機分成4組，每組20只：假手術組(Sham)、卵巢切除組(OVX)、卵巢切除組用阿侖膦酸鈉治療(OVX-ALEN)和卵巢切除組用GYY4137處理(OVX-GYY)。OVX-ALEN和OVX-GYY為治療組。GYY4137購自Santa Cruz Biotechonology(SC-224013)并用0.9%生理鹽水稀釋。阿侖膦酸鈉的商品名為A115345，用0.9%生理鹽水稀釋。在手術前將大鼠禁食過夜，自由飲水。通過腹膜內注射320 mg/kg的劑量水合氯醛(Sangon Biotech)來麻醉所有大鼠。固定在背上，腹部消毒，腹部中間切開了一個切口。發現子宮雙峰和雙側卵巢，并分離出周圍的脂肪組織。手術期間注意止血，術后用青霉素(40 000 U/只)治療大鼠3 d以避免感染。對于Sham，在分離卵巢后縫合切口。對于OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY，完全進行卵巢切除術并縫合切口。術后OVX-ALEN組以1 mg/kg的劑量皮下給予阿侖膦酸鈉(A115345)，OVX-GYY組以100μg/kg的劑量腹腔注射GYY4137。所有大鼠的給藥頻率每2 d一次。在第2、4、8和12周結束時，隨機選擇5只大鼠，通過乙醚吸入麻醉并從腹主動脈采集血液。分離血漿，完全取出兩股股骨，用生理鹽水飽和的紗布包裹分別標記，并在80 ℃保存在冷凍器中。研究期間沒有意外死亡，實驗持續時間為12周。

1.2 檢測指標

1.2.1血清學指標檢測：使用磷測定試劑盒(Solarbio，China)通過磷鉬酸UV比色法測定血磷水平。用分光光度計(ThermoFisher，USA)測量磷酸鹽吸光度和濃度。使用羅氏自動生化分析儀(cobas 8000 c702)通過比色法測定血鈣水平。使用羅氏堿性磷酸酶試劑盒，采用速度法測量ALP水平。分別使用羅氏骨鈣素或降鈣素試劑盒，采用化學發光測定OCN和降鈣素的水平。使用羅氏甲狀旁腺激素檢測試劑盒和羅氏自動生化分析儀，采用電化學發光測量對甲苯噠啉的水平。使用Huamei Rat Leptin LEP ELISA試劑盒，采用ELISA(酶聯免疫吸附測定)測定瘦素的水平。改進的亞甲藍法用于測定血漿中的H2S水平。

1.2.2骨密度和生物力學檢測：骨密度的測定使用Hologic Double Energy X Ray 4 500 W骨密度計系統(DEXA)測量腰4～5椎體骨密度。大鼠股骨生物力學改變使用ElectroForce 3200 Series II測試儀器(BOSE)采用三點彎曲實驗測量股骨骨折期間的最大應力。

1.2.3組織學檢測：左股骨使用蘇木精伊紅染色觀察，在4%多聚甲醛中固定后，將每個股骨樣品脫鈣，在乙醇中以遞增濃度脫水，在二甲苯中洗滌并植入組織石蠟中。最后，使用5 μm切片進行H&E染色。

1.3 統計學分析

實驗數據表示為均數±標準差。統計分析用SPSS 22.0軟件進行。基于方差結果的同質性檢驗，使用Student'st檢驗比較兩個不同組間差異。以P<0.05判斷差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠骨量的改變

OVX組顯示出明顯的骨小梁的減少，Sham組、OVX-ALEN組和OVX-GYY組的骨小梁較OVX組明顯增加，無明顯骨量減少(圖1)。

圖1 治療12周時大鼠股骨H&E染色切片(×40)Fig.1 HE staining of the femur in rats after 12 weeks of the treatment (×40)

2.2 血清指標的改變

與假手術組比，OVX和OVX-ALEN組的H2S水平顯著下降，但OVX-GYY組的水平沒有顯著差異(圖2)。與Sham組相比，OVX組的ALP水平在第4周顯著下降(P<0.05)。8周后，OVX-GYY組的ALP水平顯著增加，但未能恢復至2周水平(P<0.05)。 12周后，OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY組的ALP水平顯著增加(P<0.05)。然而，ALEN治療顯著降低了第8周的OCN水平(P<0.05)，而12周后的ONC水平顯著高于經過OVX手術的組(P<0.05)。與假組相比，在第4、8和12周后，PTH水平在經歷過OVX手術的組中增加(P<0.05)。同樣，OVX組的瘦素水平在第4、8和12周上升(P<0.05)。卵巢切除術后，降鈣素水平隨時間降低(圖2)。

圖2 GYY4137對卵巢切除大鼠血漿中硫化氫、鈣、磷和骨代謝量的影響。在4組大鼠中評估堿性磷酸酶(A)、骨鈣素(B)、降鈣素(C)、PTH(D)、瘦素(E)、硫化氫(F)、鈣(G)和磷(H)的水平。與Sham組相比，*P<0.05；與Sham組相比，**P<0.01；與OVX組相比，#P<0.05；與OVX相比，##P<0.01Fig.2 Effect of GYY4137 on hydrogen sulfide, plasma calcium, phosphorus and bone metabolism in ovariectomized rats. Levels of alkaline phosphatase(A), osteocalcin(B), calcitonin(C), PTH(D), leptin(E), hydrogen sulfide(F), calcium(G) and phosphorus(H) were evaluated in all four groups of rats. *P<0.05 compared to the Sham group; **P<0.01 compared to the Sham group; #P<0.05 compared to the OVX group; ##P<0.01 compared to OVX.

2.3 骨密度和生物力學改變

與Sham組相比，OVX組中股骨的BMD在第8、12周下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。 GYY4137治療緩解了12周內BMD的下降(P<0.05)，治療效果優于OVX-ALEN組(圖3)。 GYY4137改善了卵巢切除術引起的骨質疏松癥的最大骨應力。通過三點彎曲試驗測試了股骨骨折的最大應力(圖3)。結果顯示，12周后，OVX組的最大應力降低。OVX組骨質疏松癥建模以與骨質疏松癥的影響一致的方式改變股骨的最大生物力學負荷。與Sham組相比，用阿侖膦酸鹽或GYY4137治療的大鼠在最大生物力學負荷方面沒有顯著差異(P>0.05)。 OVX-ALEN和OVX-GYY組也未顯示出顯著差異(P>0.05，圖3)。

圖3 股骨骨密度和強度試驗結果。BMD測量值用于第8周的股骨骨密度(A)，股骨BMD在第12周(B)，OVX模型在第8周(C)，OVX模型在第12周(D)Fig.3 The results of the bone mineral density and strength test for the femur. The BMD measurements of the femur were performed on week 8 (A) or week 12 (B) in Sham rats, and on week 8(C) or week 12(D) in the OVX rats.

3 討論

作為內源性氣體信號分子，H2S是一個熱門的研究課題。多次研究證實了其在許多組織系統的生理和病理過程中的重要作用，包括內臟、心血管、骨骼和神經系統。例如，它可以保護心肌細胞免受缺血性疾病[8]。內源性H2S的減少可加速動脈粥樣硬化[9]。它還可以削弱對神經系統氧化應激的保護作用[10]。雌激素促進骨形成，主要由成骨細胞上的ER受體介導；還通過其ER受體誘導的破骨細胞凋亡抑制骨吸收；而骨代謝依賴于成熟和成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收的平衡[11]。

血漿中的鈣和磷水平與骨骼中的水平保持動態平衡，血漿水平反映骨組織的代謝和小腸與腎臟對鈣和磷的吸收重吸收率。在這項研究中，筆者研究了雌激素缺乏對大鼠血漿中H2S、鈣和磷酸鹽水平，骨骼宏觀力學和物理學以及相關激素分泌的影響。研究了GYY4137和阿侖膦酸鈉如何影響這些參數。在生物力學和生化指標方面，OVX-GYY組與Sham組相比沒有顯著差異。外源性GYY被證明可以提高大鼠血漿中的H2S水平，并改善由于去卵巢而導致的鈣和磷酸鹽的不平衡。H&E染色和顯微鏡觀察也證明，在GYY干預下，OVX-GYY組的骨小梁結構和數量與假手術組或OVX-ALEN組的結果無顯著差異。除直接作用于骨代謝外，雌激素可以增加降鈣素的分泌，抑制甲狀旁腺素的分泌，促進腎臟中維生素D的活化，并通過鈣調節激素增加小腸中的鈣吸收。

降鈣素是甲狀腺C細胞分泌的一種多肽激素。它作用于降鈣素受體，抑制破骨細胞的活化，刺激成骨細胞的增殖，并防止細胞凋亡[12]。降鈣素還可間接抑制甲狀旁腺和維生素D的活化，降低血液中鈣的含量。其水平與年齡無關，因此降鈣素和代謝率的基本上對于骨質疏松癥患者沒有顯著變化，這與本研究結果一致。甲狀旁腺以脈沖方式分泌甲狀旁腺素，作用于成骨細胞的甲狀旁腺素受體以增強骨形成。甲狀旁腺素的異常分泌，如由甲狀旁腺功能亢進引起的持續豐富的分泌，可以增加破骨細胞的活性，導致骨吸收和骨質疏松癥。本研究表明，甲狀旁腺素水平隨著時間的推移而降低，這可能與血漿中雌激素的減少有關。在OVX-ALEN組中，阿侖膦酸鈉調節降鈣素和甲狀旁腺素。然而，GYY對OVX-GYY組中的這兩種激素沒有顯著的調節作用。

瘦素是一種由白色脂肪組織分泌的全身激素，與骨代謝有更復雜的調節關系。通常認為它作用于下丘腦長受體以通過神經內分泌軸調節骨代謝[13]。它還可以通過骨組織周圍的短受體直接調節骨代謝。本研究觀察到H2S可能有助于調節瘦素水平。血漿中大約50%的ALP來自成骨細胞[14]。OCN是由成骨細胞直接分泌和表達的活性多肽，它們都反映了成骨細胞的活性和狀態，代表了骨形成和重建[14]。有趣的是，阿侖膦酸鈉和GYY4137均未對OVX組中的ALP或OCN產生顯著的調節作用，這需要進一步研究。

一些研究表明，由間充質干細胞產生的H2S可以調節骨骼分化，并且H2S的減少可以減少鈣通道的硫化，從而影響Ca2+通路的內部流動；這會減少間充質干細胞向成骨細胞的分化[15]。在一些實驗中，還觀察到H2S介導氧化應激損傷，促進成骨細胞的增殖和分化[16]。這些陳述與本研究的結果一致，表明H2S對骨代謝的益處及其改善骨質結構的潛力。外源性H2S可以介入和調節卵巢切除大鼠的骨質疏松癥。在某些情況下，它甚至可以治愈由卵巢切除術引起的骨質疏松癥[17]。

總之，卵巢切除的大鼠在本研究中用作受試者，以探索血漿中內源性H2S水平與骨質疏松癥之間的關聯。通過腹腔注射GYY4137作為內源性H2S的補充，本實驗發現提高和維持血漿中H2S的生理水平可以調節鈣和磷的代謝平衡，且骨代謝的常見臨床指標的影響如OCN、鈣調素、堿性磷酸酶、甲狀旁腺素和瘦素。研究結果表明，GYY4137是一種比阿侖膦酸鈉更好的干預措施，對卵巢切除術引起的骨質疏松癥有一定的治療作用。