異紫杉脂素治療對去卵巢大鼠骨量流失和骨密度降低保護作用的機制研究

陳建軍 焦宏偉 張敬

1.海南省干部療養院(海南省老年病醫院)中西醫結合內科，海南 ?？?571100 2.海南省干部療養院(海南省老年病醫院)內分泌科，海南 ?？?571100 3.海南醫學院第一附屬醫院康復醫學科，海南 ?？?570311

隨著我國人口老齡化的增加，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)已成為最常見的慢性病之一[1]。OP是一種以骨量減少、骨密度降低、骨結構退化為特征的代謝性骨科疾病。OP多見于老年和絕經后婦女，女性發病率高于男性[2]。OP患者體內骨代謝平衡被打破，骨吸收遠大于骨形成；引起骨痛、脊柱后凸、身高縮小、呼吸功能下降和骨折等嚴重損害全身的癥狀[3]。目前，鈣、體育鍛煉和骨吸收抑制劑被廣泛用于OP的治療，但這些藥物只能緩解患者的癥狀，不能預防疾病的發生[4]。紅豆杉分布在我國云南省，以其抗癌化學成分紫杉醇而聞名。在當地，這種樹由于壽命長并且對老年人的慢性疾病如腎功能不全和糖尿病具有改善作用，因此被稱為不老樹。異紫杉脂素(Isotaxiresinol，IXO)是從紅豆杉提取一種芳基四氫萘型木脂素[5]，具有良好的抗炎、抗癌及調節免疫的功效，且具有類雌激素的作用[6]。因此，本研究假設異紫杉脂素對絕經后骨質疏松癥有保護作用，使用去卵巢切除(OVX)大鼠模型評估IXO的抗骨質疏松活性并探索可能的機制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和藥物治療

從上海實驗動物中心獲得雌性SD雌鼠(3月齡，230～260 g)，并在可控溫度和濕度的房間中保持12 h的明暗循環。在實驗期間，允許實驗大鼠自由進食實驗室顆粒飼料和水。適應飼養7 d后，使用水合氯醛(40 mg/kg)腹膜內麻醉大鼠，并暴露其兩個卵巢，立即結扎卵巢并切除；假手術組僅通過暴露卵巢進行假手術。隨后大鼠隨機分為3組：假手術組(Sham)、去卵巢組(OVX)及異紫杉脂素組(IXO)；IXO組大鼠在去卵巢大鼠手術1周后每天給予劑量為100 mg/kg異紫杉脂素(上海莼試生物技術有限公司購買，批號：322123，純度>98%)進行灌胃治療，為期12周，其余幾組同時給予生理鹽水灌胃治療。治療12周后，通過腹膜內注射水合氯醛麻醉所有動物，從主動脈靜脈收集血液，并將血清保持在-70℃以下。然后，處死大鼠收集雙側股骨進行下一步檢測。

1.2 Micro-CT檢測

使用CANCOuCT80(Micro Computed Tomography，Micro-CT)對左股骨遠端進行微計算機斷層掃描。體素大小為0.08 mm，切片厚度為0.5 mm，皮質閾值為464 mg/cm3。使用測量模式將整個骨骼分為皮層或松質骨作為剝離模式。此模式可以自動檢測內部閾值。獲得偵察掃描并確定生長板后，在生長線以下的左股骨遠端1～5 mm區域掃描100個橫截面切片的橫向圖像集。骨微結構參數包括骨密度(BMD)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁分離度(TBSp)，通過使用內置軟件進行定量分析來確定微觀參數。

1.3 骨代謝指標檢測

通過使用免疫測定試劑盒(GuYan Biotech Co.,Ltd. Shanghai，China)測量血清Ⅰ型前膠原N端前肽(P1NP)水平來評估骨形成。通過使用免疫測定試劑盒(Fubo Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China)測量Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)的血清濃度來評估骨吸收。

1.4 HE組織切片分析

Micro-CT檢測完畢后，使用10%EDTA脫鈣4～6周，每周換液一次；脫鈣完畢后在10%福爾馬林中固定過夜，然后包埋在石蠟中。用蘇木精和曙紅(H&E)對包埋標本的連續切片進行染色，光學顯微鏡觀察并選取合適部位進行觀察。

1.5 蛋白質印跡檢測

將裂解緩沖液添加到裂解的骨組織中行冰浴1 h。然后，將組織放入離心機中以14 000 g離心10 min，并使用BCA方法對蛋白質進行定量。接下來通過微讀數器獲得蛋白質的吸光度和標準曲線，將其用于計算組織中的蛋白質濃度。隨后，對組織樣本中的蛋白質進行變性和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。當標記蛋白以直線到達玻璃板的底部時，觀察到標記蛋白的位置并停止電泳。然后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，美國)上，并與封閉緩沖液反應1.5 h。之后，依次添加抗PI3K一抗(1∶1000)，抗Akt一抗(1∶1000)，抗RUNX-2一抗和二抗(1∶1000)；β-actin作為內參蛋白。漂洗后在黑暗中用化學發光試劑對蛋白質進行足夠的顯色，持續1 min。

1.6 統計學分析

數據使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。數據使用均數±標準差表示。使用單向方差分析及事后檢驗對多組之間差異進行比較。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 Micro-CT檢測結果分析

股骨的干骺端骨小梁三維重建如圖1A所示，股骨的微觀參數如圖1B～F所示。OVX組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低(P<0.05)，而Tb.Sp較Sham組明顯升高。IXO組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp較OVX組明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨小梁形態學檢測結果Fig.1 Morphological test results of the femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats注：和Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.2 組織切片結果分析

各組大鼠治療12周時股骨干骺端進行H&E染色結果，如圖2所示。在OVX組中，組織學檢查顯示出大量的骨小梁已經消失和少量不規則排列的骨小梁。而使用IXO治療后的骨小梁相比；骨小梁的數量和之間的連接在一定程度上得到了改善。

圖2 三組大鼠股骨的組織病理學 A：Sham，B：OVX，C：IXO，蘇木精-伊紅染色(放大倍數，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups. A：Sham，B：OVX，C：IXO，Hematoxylin eosin staining (Magnification，×10)

2.3 骨代謝指標分析

三組大鼠治療12周后血清骨代謝指標水平如圖3中。與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠血清中P1NP和β-CTX水平顯著升高(P<0.05)。然而，使用IXO治療顯著降低P1NP和β-CTX顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠血清骨代謝指標的水平Fig.3 Serum bone metabolism index levels in each group of rats注：Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.4 治療對PI3K、Akt和RUNX-2表達的影響

IOX治療對PI3K、Akt和RUNX-2表達的影響如圖4所示。圖4顯示了OVX組大鼠的PI3K、Akt和RUNX-2水平較Sham組顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比，IOX治療后的股骨組織中PI3K、Akt和RUNX-2水平表達上調(P<0.05)。

圖4 使用WB檢測PI3K、Akt和RUNX-2相對表達Fig.4 Relative expression of PI3K, Akt, and RUNX-2 using Western blotting注：Sham組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質疏松癥是嚴重威脅老年人健康和生活質量的疾病，隨著社會人口老齡化的發展，其發病率逐年上升。特別是絕經后的老年婦女中骨質疏松癥的發生率極高，并且由此引起的并發癥，例如疼痛和骨質疏松性骨折，嚴重影響患者的身心健康以及生活質量。此外，全社會已在預防和治療該疾病方面投入了大量的人力、物力和財力[7]。因此，預防骨質疏松相關并發癥對臨床治療骨質疏松癥具有重要意義。

目前的研究認為骨質疏松癥的發生與破骨細胞和成骨細胞在體內的功能紊亂和比例失調引起的骨代謝紊亂密切相關。有研究報導[8-9]顯示，絕經后婦女的雌激素含量急劇下降，這導致破骨細胞功能亢進和體內成骨細胞抑制，從而使破骨細胞誘導的骨破壞明顯超過成骨細胞誘導的骨形成并導致去骨質疏松癥。同時，骨髓間充質干細胞是體內成骨細胞和破骨細胞分化的主要來源，而在刺激雌激素減少的情況下，分化為成骨細胞的大量骨髓間充質干細胞的比例降低，從而進一步影響了骨骼形成并導致骨質減少。在本研究中，采用雌性大鼠去卵巢，從而引起雌激素的突然減少。12周后，檢測大鼠股骨骨密度，去卵巢大鼠骨密度顯著下降，說明本研究去卵巢誘導骨質疏松大鼠模型制備成功。異紫杉脂素被腸細菌轉化為激素樣哺乳動物衍生物腸二醇，然后被結腸菌群氧化為腸內酯。腸二醇和腸內酯通過與雌激素受體(ER)結合而發揮其雌激素作用，或通過與內雌激素競爭ER表現出抗雌激素作用[10]。因此，異紫杉脂素在雌激素依賴性疾病如乳腺癌、結腸癌、肝癌和前列腺癌以及更年期癥狀的治療中表現出作用[10]。異紫杉脂素可認為是一種具有雌激素活性的植物雌激素。本研究使用異紫杉脂素治療12周發現去卵巢大鼠骨密度、骨量較OVX組顯著改善，再次證實了異紫杉脂素有抗絕經后骨質疏松癥的效果。

骨轉換包括兩個連續的過程：舊骨的去除和新骨的形成。在本研究中，使用Micro-CT發現OVX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，用異紫杉脂素治療后，BMD、BV/TV，Tb.N和Tb.Th與OVX組相比顯著改善，表明骨小梁的微觀結構得到改善。血清β-CTX是骨骼中I型膠原的降解產物。檢測血清β-CTX含量可以特異性地反映破骨細胞的吸收活性。成骨細胞可以分泌骨特異性P1NP，P1NP可以反映骨形成的狀態。血清學指標顯示OVX組的β-CTX和P1NP較Sham組明顯升高，而異紫杉脂素治療后大鼠的骨轉換速度較OVX組明顯下降。本研究表明異紫杉脂素可降低骨代謝速度來促進OVX大鼠的骨形成來保護骨組織。

PI3K/Akt信號傳導途徑是至關重要的細胞信號轉導途徑，已被證實在諸如細胞增殖，分化，凋亡和壞死等生理和病理過程中起著重要的調節作用。研究[11]報道，PI3K/Akt細胞信號傳導途徑可以激活β-catenin及其磷酸化，而且它可以促進下游信號通路中靶基因的轉錄和蛋白質的翻譯。同時，由PI3K/Akt信號通路中的Akt磷酸化產生的p-Akt能夠促進β-catenin的磷酸化并觸發細胞增殖[12]。簡而言之，細胞中的PI3K和P85可以通過各種刺激來激活，從而募集并激活細胞周圍的P110，從而對細胞膜表面的磷脂酰肌醇二磷酸起作用并激活，從而形成大量的磷脂酰肌醇三磷酸[13]。作為第二信使，磷脂酰肌醇三磷酸可以進一步激活Akt的磷酸化以生成p-Akt，從而在信號轉導中發揮作用，通過下游GSK3β和Wnt途徑發揮協同作用，并調節細胞分化的發生[14]。本研究結果表明，在去卵巢大鼠的PI3K/Akt信號通路較Sham組的大鼠明顯被抑制，PI3K、Akt及RUNX-2蛋白的表達水平顯著降低，而在經過IXO治療后，PI3K/Akt信號通路較OVX組明顯激活，PI3K、Akt及RUNX-2相關蛋白表達明顯上調。因此筆者認為IXO能保護去卵巢對大鼠骨量破壞作用可能是介導PI3K/Akt信號通路來實現的。

總的來說，異紫杉脂素可能通過降低骨轉換速度及激活PI3K/Akt信號通路來改善骨密度、骨微觀結構和骨強度以及治療絕經后骨質疏松癥。