淫羊藿苷防治股骨頭壞死分子機制研究進展

章曉云 李華南 陳躍平

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004 2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院骨科，廣西 南寧 530011 3.江西中醫藥大學附屬醫院骨傷三科，江西 南昌 330006

中醫學認為腎主骨生髓，腎氣充足則骨骼得以生長、修復，腎氣虛則骨痿，而股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)在古時稱之為“骨蝕、骨痿、骨痹”。目前以腎主骨理念為指導進行中醫藥治療股骨頭壞死的研究中，淫羊藿是研究比較成熟的中藥之一。淫羊藿始載于《神農本草經》，列為中品，認為其“味辛，寒。主陰痿絕傷，莖中痛，利小便益氣力，強志”，《本草經集注》補充提出：“其可堅筋骨，消瘰疬，赤癰”?，F代醫學研究[1-3]表明淫羊藿治療ONFH效果明顯，主要通過影響Wnt、RANK/RANKL、PI3K-Akt、Notch、MAPK、TGF-β、HIF-1、FoxO等信號通路發揮治療ONFH的作用。中藥藥理研究表明淫羊藿苷(Icariin，ICA)是其主要藥效成分，可有效改善骨代謝平衡，增強骨密度與強度[4]，現將ICA治療ONFH的分子機制研究綜述如下。

1 ICA通過經典Wnt/β-catenin促進成骨細胞增殖分化

Wnt信號通路可調節成骨細胞、腫瘤細胞、腎臟細胞等多種細胞的分化、增殖、遷移。Wnt信號通路主要有經典Wnt/鈣離子、Wnt/PCP與Wnt/β-catenin 3種信號通路，其中Wnt/β-catenin信號通路為經典通路。Wnt蛋白與存在于細胞表面的Frizzled家族蛋白受體、低密度脂蛋白受體關聯蛋白LRP6及LRP5進行結合后從而激活Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制axin、GSK-3、APC蛋白對β-catenin蛋白的降解作用，使β-catenin在細胞質內的含量得以穩定，并最終與核內轉錄因子(TCF/LEF)結合促進下游特定基因的表達，這是參與調節細胞增殖分化的主要路徑。Wnt/β-catenin信號通路可調節成骨細胞與破骨細胞增殖分化，在骨生成與代謝過程中扮演著非常重要的角色。因此，尋找激活Wnt信號通路以調節成骨細胞與破骨細胞之間骨代謝平衡的方法成為治療股骨頭壞死的關鍵。隨著對淫羊藿研究的不斷深入后發現其主要藥效成分ICA可以通過刺激經典Wnt/β-catenin信號通路從而達到刺激成骨細胞增殖分化，并抑制破骨細胞形成的效果，其可改善骨代謝平衡，抑制股骨頭壞死的進一步發展。Wang等[5]研究表明ICA可激活Wnt信號通路，提高成骨細胞增殖分化所需的相關因子β-catenin、Runx2、cyclinD 1和ALP的表達水平，從而促進成骨細胞分化。Liu等[6]在小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)損傷模型中加入ICA后發現其增強了暴露于超負荷狀態下成骨細胞的增殖，促進了MC3T3-E1細胞分化和礦化，其中ALP、β-catenin和Runx 2的基因和蛋白表達水平與實驗對照組相比均有提高。這說明ICA可通過提高β-catenin在胞內的表達水平，從而激活Wnt/β-catenin信號通路的表達，進一步促進β-catenin與TCF/LEF結合。另外，ICA可提高成骨分化相關基因蛋白的表達，最終促進成骨細胞增殖分化(圖1)。由此可見ICA可通過經典Wnt/β-catenin促進成骨細胞增殖分化。

圖1 ICA通過經典Wnt/β-catenin促進成骨細胞增殖分化機制Fig.1 Mechanism of icariin promoting osteoblast proliferation and differentiation through Wnt/β-Catenin

2 ICA介導RANK/RANKL信號通路抑制破骨細胞分化

破骨細胞由多核巨細胞組成，促進骨吸收為其主要功能，這使它在骨的生長發育、修復代謝中發揮著重要作用，但過快的破骨細胞增殖分化會引起骨質被過度吸收，使股骨頭區域的骨代謝平衡被打破從而引起股骨頭局部出現骨塌陷。破骨細胞的增殖、分化及發育主要與兩種細胞因子有關，即巨噬細胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)與NF-κB配體受體活化因子(receptor activator of NF-κβ，RANK)。當RANK與破骨細胞前體表面的受體RANKL相結合后，會進一步與銜接分子TRAF6相互作用，而TRAF6作為MAPK、NF-κB以及一些破骨細胞相關基因的催化細胞因子，可激活MAPK、NF-κB信號通路促進破骨細胞形成與分化，因此阻止RANK與RANKL結合是抑制破骨細胞分化的方式之一。Kim等[1]研究表明ICA抑制破骨細胞不僅可以通過OPG/RANK/RANKL信號通路，還可以通過調節RANKL介導的TRAF6/NF-κB/ERK信號通路來抑制破骨細胞的形成。TRAF6是RANK/RANKL在早期吸引而來的細胞分子，被視為破骨細胞增殖分化的主要標志物。當TRAF6含量受到明顯抑制時，則會出現破骨細胞分化緩慢，成熟破骨細胞形成有關的NF-κB蛋白表達受到抑制，而該蛋白恰好是RANK/RANKL途徑的重要下游靶標。目前發現骨保護素(osteoprotegerin，OPG)可抑制RANK/RANKL信號通路的表達，它通過與RANKL相結合，阻斷RANK與RANKL的結合，從而減少破骨細胞分化，提高骨量，并且RANKL/OPG比值被視為衡量骨量的重要指標之一[7]。Sun等[8]研究表明ICA可提高成骨相關基因ALP，BGP及OPG/RANKL的表達水平促進成骨分化，同時降低骨吸收標志物TRACP-5b水平抑制骨吸收，從而維持骨代謝平穩。吳峻等[9]研究表明ICA通過提高OPG的水平，降低RANKL及RANK的表達水平，從而提高血清中BGP、ALP及Ca2+的水平，最終抑制成骨細胞凋亡。OPG作為成骨細胞分泌的一種細胞因子，當ICA促進成骨細胞增殖分化時，其OPG的分泌也將隨之增多，這對抑制破骨細胞分化有著非常積極的作用。由此可見，ICA可通過抑制RANK/RANKL信號通路及其下游相關靶基因抑制破骨細胞的分化，見圖2。

圖2 ICA介導RANK/RANKL信號通路抑制破骨細胞分化機制Fig.2 Mechanism of icariin-mediated RANK/RANKL signaling pathway inhibiting osteoclast differentiation

3 ICA通過刺激DEC1與PI3K/AKT信號通路調節骨代謝

人分化的胚胎軟骨細胞表達基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene1，DEC1)是基本螺旋-環-螺旋蛋白的一種。它參與機體多種生理過程，包括生理節律性、生理代謝的動態平衡與細胞增殖、分化和凋亡。研究[10]發現DEC1的表達水平與BMSCs中成骨細胞的表達密切相關，DEC1的過表達會加速BMSCs向軟骨分化，相反DEC1的低表達會抑制BMSCs的成骨分化。另一篇報道[11]中發現DEC1在生長期軟骨細胞中的過度表達會增加Runx2和X型膠原的mRNA水平，并使ALP活性提高，從而促進成骨細胞分化及細胞礦化，這說明DEC1可通過某種信號通路表達調控成骨分化。雖然目前這種機制尚未被證實，但是仍可尋找相關藥物介導DEC1的表達水平調控成骨細胞的分化。研究證實[12-13]地塞米松可顯著降低DEC1表達水平，而ICA作用相反。Hu等[14]研究表明ICA可提高DEC1表達水平，并且可逆轉因地塞米松引起的DEC1低表達，這種改變主要依賴藥物濃度，研究還證實了DEC1可促進成骨分化，并認為ICA可作用PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin信號通路參與誘導的成骨過程，促進成骨分化。PI3K信號通路可通過激活下游靶基因蛋白參與多種細胞增殖分化凋亡及葡萄糖轉運，其中AKT是PI3K通路中的一種關鍵激酶，它與PI3K結合可構建成多種信號的中心網絡。有研究認為PI3K/AKT信號通路可通過激活下游細胞因子如HIF-1α、BMPs、GSK-3β等以促進血管修復、調節骨代謝平衡，對治療股骨頭壞死具有非常重要的意義[15]。其中GSK-3β不僅在Wnt/β-catenin信號中扮演著重要角色，而且當GSK-3β受到激活后出現磷酸化可抑制β-catenin的降解，提高β-catenin在胞質內的濃度，并與下游成骨細胞核內靶基因cyclin D1與c-myc相結合，從而加速破骨細胞凋亡及成骨細胞增殖分化[16-18]。GSK-3β還可通過抑制NFATc 1與DNA結合的能力，從而抑制破骨分化[19]。由此可見，ICA通過提高體內PI3K、β-catenin、GSK-3β基因的表達水平從而對股骨頭壞死血管損傷的修復以及骨代謝平衡的維持具有非常積極的作用。ICA不僅可單獨通過提升DEC1的表達水平促進成骨分化，還可刺激PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin的表達促進修復血管，恢復血供，調節骨代謝平衡，這為股骨頭壞死的治療提供了一種潛在的方法(見圖3)。

圖3 ICA通過刺激DEC1與PI3K/AKT信號通路調節骨代謝分子機制Fig.3 Molecular mechanism of icariin regulating bone metabolism by stimulating DEC1 and PI3K/Akt signaling pathway

4 ICA通過抑制Notch信號促進成骨分化

Notch基因最早由托馬斯于1917年研究果蠅翅膀邊緣切跡原因時發現，而該基因形成的信號通路是一條涉及機體幾乎所有細胞增殖分化活動的信號轉導通路，并在調節細胞生理及病理過程中起重要作用。該信號通路主要由Notch受體及其配體(DSL蛋白與CSL蛋白)、Notch調節因子及其他效應物組成。當該受體與配體結合后會在Notch跨膜區胞外端的s1、s2、s3位點分別被furin蛋白酶、ADAM家族的腫瘤壞死因子-α-轉換酶或kuzbanian(Kuz)、早老素(PS)進行3次酶切，形成可溶性NICD并轉移至核內與CSL蛋白結合，最終與DNA形成多蛋白-DNA復合體，可激活成骨細胞與破骨細胞相關基因的表達。目前有研究證實Notch信號通路在MSCs的多向分化中發揮著重要作用，主要表現為抑制成骨分化[20]。多種因素可抑制該信號通路表達而促進成骨分化，如ICA、磷酸鈣及鍶等[21-23]。Xu等[23]通過RNA測序顯示ICA治療后Notch通路中多個基因表達降低，光電導繼電器進一步檢測顯示Notch配體Jagg-1、lunatic fringe基因和Notch信號下游靶基因Hey-1的mRNA水平也顯著下降，這提示ICA可通過抑制Notch信號通路的表達從而促進成骨分化，有效提高骨量。鄧宇等[24]研究表明ICA通過激活 Notch 信號通路促進骨BMSCs向成骨細胞分化，實驗中還發現ICA提高了BMSCs細胞成骨分化相關因子中Hesl、Runx2、mRNA的表達，但Notch1、Jagged1、CBF1蛋白表達水平也同樣上升了。上述兩項研究提示Notch信號通路在成骨分化的作用上仍存在爭議，需要后期更深入的研究，但ICA可作用于該信號通路刺激成骨分化是普遍認可的(見圖4)。

圖4 ICA通過抑制Notch信號促進成骨分化機制Fig.4 Mechanism of icariin promoting osteogenic differentiation by inhibiting Notch signal

5 ICA通過MAPK通路誘導BMSCs的成骨分化

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)是一種由多種信使組成的家族，主要有ERK、p38激酶和JNK 3種。ERK介導的信號通路一直是BMSCs成骨分化過程中研究的熱點。既往研究[25]表明BMSCs成骨或成脂分化可通過ERK的激活或抑制進行控制，而且PDGF、FGF和IGF-I等多種骨活性劑均可通過ERK信號途徑誘導成骨分化[26]。p38信號通路是成骨分化過程中的介體，調控p38也可促進BMSCs在體外成骨分化。研究已證實p38信號通路在體外有助于促進成骨細胞功能表達和體內骨礦化[27]，而 JNK信號通路在人骨膜細胞成骨細胞分化中發揮著重要作用[28]。MAPK信號通路在細胞膜外可被多種因素刺激激活，包括激素、化學與物理刺激、神經遞質、細胞因子等，激活后可從細胞表面傳遞到細胞核，調控基因表達從而控制細胞增殖、分化和凋亡。目前有研究認為ICA可作為細胞外因素刺激MAPK信號通路誘導BMCs進行成骨分化[29]。Wu等[30]研究發現20 μmol/L的ICA雖然不能刺激BMCs的增殖，但是可刺激它向成骨分化，并認為這是ICA可刺激成骨相關細胞因子導致的結果。為進一步研究MAPK級聯在ICA誘導成骨分化中的作用，他們對ICA刺激下ERK、p38和JNK的蛋白水平進行檢測，并運用相關抑制劑做對比實驗發現，ERK、p38和JNK表達水平與對照組比在培養15～120 min后都有所上升，這證實了MAPK參與ICA誘導BMSCs成骨分化的過程，但筆者認為在今后仍需做更多實驗去佐證。具體機制見圖5。

圖5 ICA通過MAPK通路誘導BMSCs的成骨分化機制Fig.5 Mechanism of icariin inducing BMSCs osteogenic differentiation through MAPK pathway

6 總結與展望

目前淫羊藿在治療股骨頭壞死、骨質疏松癥以及骨性關節炎等方面具有良好的臨床療效，已被廣大臨床工作者逐漸接受。ICA作為淫羊藿的主要藥效成分，對于上述疾病的有效治療作用已通過實驗研究得到充分證實。通過對ICA治療ONFH的分子機制進行綜述后，筆者認為ICA主要可通過以下幾種途徑促進ONFH修復：①通過經典Wnt/β-catenin促進成骨細胞增殖分化；②介導RANK/RANKL信號通路抑制破骨細胞分化；③刺激DEC1與PI3K/AKT信號通路調節骨代謝；④抑制Notch信號促進成骨分化；⑤刺激MAPK通路誘導BMSCs的成骨分化。這些都有助于成骨細胞在股骨頭壞死早期的增殖分化，抑制破骨細胞分化從而增加股骨頭骨量以及骨強度。另有研究發現 HIF-1α信號通路可作為PI3K/AKT信號通路下游基因靶點，促進血管內皮細胞的增殖，增加一氧化氮的分泌從而提高血管通透性，可有效改善股骨頭周圍血運狀態[31-32]。目前仍缺乏針對HIF-1α、TGF-β、FoxO 等自身信號通路的動物實驗研究，筆者認為這些尚未發現的信號通路作用方式可能存在于上述相關通路的下游，需要進一步通過實驗驗證。