響應面法優化脫乳清風味調料乳的生產工藝

和麗，郭楚雅，王雪峰，2，*，普岳紅，2，范江平，2，黃艾祥

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201；2.云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南昆明650201）

隨著社會的發展和進步，人們對乳及乳制品的需求量不斷增加。當前我國在營養層面對乳及乳制品進行研究的同時，也對其風味進行了研究[1]。發酵乳是乳制品中的一種，是以牛乳或乳粉為原料，發酵后制成的pH值降低的產品[2-3]，其可分為酸乳和風味發酵乳[4]。發酵乳具有豐富的營養和良好的保健功能[5-6]，并以其獨特的風味、極高的營養價值受到越來越多人的喜愛[7]。它可以促進人體對蛋白質的吸收，幫助乳糖不耐癥患者食用牛奶，減少脹氣、腹瀉等癥狀[8]，還可以助消化，潤腸通便且熱量低又不會胖[9]。然而，目前國內外對調味料型發酵乳的研究鮮有報道，其作為一種新型發酵乳可以進一步豐富發酵乳的種類。本試驗以鮮牛乳、香辛料為原料，利用實驗室自制貫筋藤蛋白酶酶解牛乳[10]，脫去乳清，并以感官評分為指標，利用單因素試驗和響應面分析法優化脫乳清風味調料乳發酵工藝條件，開發出一款獨具香辛料風味、食用方式多樣性的脫乳清調料乳，為特色發酵乳產業的開發提供一定的理論應用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳、乳清蛋白粉、貫筋藤蛋白酶（酶活力為223.135U/mL）、商業直投式酸奶發酵劑（DELVO-YOG?FVV-231DSL直投式菌種）：由云南農業大學食品科學技術學院實驗室提供；白砂糖、黑胡椒粉、生姜粉、花椒油、辣椒油、海鹽：市售。

MRS 肉湯培養基、NaOH、酚酞、K2SO4、CuSO4、HCl、H2SO4、甲基紅-溴甲酚綠指示劑、異戊醇：天津市鳳船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SVJ-358型智能商用型酸奶機：北京世紀陽光科技發展有限公司；HPX-9272ME型恒溫培養箱：上海博訊實業有限公司；SW-CJ-IF型單人雙面超凈無菌操作臺：蘇州江東精密儀器有限公司；GMSX-280型壓力蒸汽滅菌器：北京市永光明醫療儀器有限公司；雷磁PHSJ-4A型實驗室pH計：上海精密科學儀器有限公司；HJJ-6恒溫水浴鍋：常州華奧儀器制造有限公司；NDJ-4型旋轉黏度計：武漢格萊莫檢測設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝設計

生鮮乳→驗收→預熱→均質→凝乳→切塊→脫乳清→添加香辛調味料→攪打→滅菌→冷卻→接種→發酵→冷藏后熟→成品。

1.3.2 感官評價

組織12位具有一定專業知識的人員經培訓組成評價小組，進行感官評分，根據色澤（25分）、氣味（25分）、組織狀態（25分）、整體口感（25分）4個方面對風味調料乳進行評定，最后得分為12位評分員評分的算術平均值。感官項目權重的分布見表1。

表1 脫乳清風味調料乳感官評定評分表Table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

續表1 脫乳清風味調料乳感官評定評分表Continue table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

1.3.3 香辛料質量比對脫乳清風味調料乳感官品質的影響

以脫乳清風味調料乳感官評分值為指標，參考美式凱撒、法式醬、千島醬等沙拉醬品種及我國居民口味，選用花椒油、辣椒油、海鹽、黑胡椒、生姜粉作為原材料[11]，以生姜粉添加量（g）作為基準項，按以上排序的不同比例添加到脫乳清發酵乳中，篩選出最佳香辛料質量比。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 凝乳酶添加量對產品感官品質的影響

貫筋藤凝乳功能成分為一種復合蛋白酶，主要是分子量為24 kDa的半胱氨酸蛋白酶B，該酶具有耐高溫、耐酸堿性能較好、凝乳活力較高等酶學特性[12]。以感官評分為指標，考察貫筋藤凝乳酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）對脫乳清風味調料乳感官評分的影響。

1.3.4.2 白砂糖添加量對產品感官品質的影響

以感官評分為指標，考察白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）對脫乳清風味調料乳感官評分的影響。

1.3.4.3 發酵時間對產品感官品質的影響

以感官評分為指標，考察發酵時間（6、8、10、12、14、16 h）對脫乳清風味調料乳感官評分的影響。

1.3.4.4 乳清蛋白粉添加量對產品感官品質的影響

以感官評分為指標，考察乳清蛋白粉添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對脫乳清風味調料乳感官評分的影響。

1.3.5 響應面試驗因素水平表

在單因素試驗的基礎上，利用響應面Box-Behnken試驗設計，以感官評分為響應值，選取感官評分影響較為顯著的A凝乳酶添加量（%）、B白砂糖添加量（%）、C發酵時間（h）、D乳清蛋白粉添加量（%）4個因素，進行四因素三水平的試驗設計，優化脫乳清風味調料乳的工藝參數。響應面分析因素及水平見表2。

表2 響應面試驗分析因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 產品理化及微生物指標測定方法

1）酸度的測定：參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[13]進行測定。

2）蛋白質的測定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[14]進行測定。

3）脂肪的測定：參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[15]進行測定。

4）微生物指標的測定：參照GB 4789.18-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳與乳制品》[16]進行測定。

2 結果與分析

2.1 不同香辛料質量比對脫乳清風味調料乳感官品質的影響

不同香辛料質量比對脫乳清風味調料乳感官品質的影響見圖1。

圖1 不同香辛料質量比對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.1 Effect of different spice ratio on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖1可知，根據工藝設計經過多次重復試驗確定每千克牛奶中添加花椒油12 g、辣椒油10 g、海鹽8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g，即香辛料質量比為6∶5∶4∶2∶1的感官評分最高，該條件下制成的脫乳清風味調料乳質地均勻、香辛料風味較佳。

2.2 脫乳清風味調料乳的單因素試驗

2.2.1 凝乳酶添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響

凝乳酶添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響見圖2。

圖2 凝乳酶添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.2 Effect of the amount of rennin added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

凝乳酶[17]添加量在脫乳清風味調料乳的制備過程中至關重要，是脫乳清風味調料乳組織狀態的主要影響因素。由圖2可以得出：感官評分在凝乳酶添加量為0.4%時最高，但之后隨著凝乳酶添加量的增加而下降，發酵乳口感干澀、帶有苦味，可能是貫筋藤凝乳酶本身含有的澀味隨添加量的增加而愈加苦澀，且影響發酵乳中的組織狀態，對發酵乳的感官品質有所影響[18]。因此，選取最佳凝乳酶添加量為0.4%。

2.2.2 白砂糖添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響

白砂糖添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.3 Effect of the amount of white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖3可以得出，隨著白砂糖添加量的增加，脫乳清風味調料乳的感官評分逐漸升高之后有降低的趨勢，當白砂糖添加量為4%時，風味調味乳的感官品質最高，感官評分為81.5分，白砂糖可以為調料乳中乳酸菌的生長繁殖提供豐富的碳源，還可以作為甜味劑，賦予調料乳更好的風味。當白砂糖添加量較低時，乳酸菌的繁殖能力較低，并且產酸和產風味物質的能力較弱；當白砂糖添加量過高時，酸奶中的甜度突出，抑制了乳酸菌的生長繁殖[19]，因此導致調料乳酸甜口感消失且不符合當代人們飲食的健康性，對發酵乳的感官品質有所影響[20]。降低了風味調料乳的感官品質。故白砂糖最佳添加量為4%。

2.2.3 發酵時間對脫乳清風味調料乳感官品質的影響。

發酵時間對脫乳清風味調料乳感官品質的影響見圖4。

圖4 發酵時間對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖4可以得出，隨著脫乳清風味調料乳發酵時間的延長，脫乳清風味調料乳發酵在不斷進行，感官評分呈上升趨勢，但在發酵14 h后，脫乳清風味調料乳的感官評分開始降低；前期可能是因為發酵時間過短，調料乳酸度不足且不凝固，而后期隨著發酵時間延長，調料乳酸味過重，遮蓋了脫乳清風味調料乳的風味，影響脫乳清風味調料乳的滋味[21]。故選取最適發酵時間為14 h。

2.2.4 乳清蛋白粉添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響

乳清蛋白粉添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響見圖5。

圖5 乳清蛋白粉添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.5 Effect of the amount of whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖5可以得出，脫乳清風味調料乳的感官評分隨著乳清蛋白粉添加量的增加而先上升后下降，乳清蛋白粉添加量在0.6%處達到最大值。隨著乳清蛋白粉添加量的增加，脫乳清風味調料乳的感官評分反而降低，可能因為乳清蛋白粉過高，導致發酵乳的風味、口感下降，且發酵乳組織狀態過于凝固[22]，香辛調味料攪拌后分布不均勻，影響了感官評分。故選取最適乳清蛋白粉添加量為0.6%。

2.3 響應面優化脫乳清風味調料乳生產工藝

2.3.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，建立Box-Behnken Design中心組合設計試驗模型，通過擬合二次方程計算最優工藝組合以及脫乳清風味調料乳最大理論值。選擇凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發酵時間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）進行四因素三水平響應面試驗，試驗結果見表3。

表3 響應面分析方案及結果Table 3 Response surface analysis and results

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3進行多元回歸擬合，分別對脫乳清風味調料乳生產工藝條件凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發酵時間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）進行試驗數據分析，回歸模型的方差分析結果見表4。

表4 方差分析結果Table 4 Variance analysis results

由表4方差分析可知，感官評分回歸模型顯著性檢驗P＜0.000 1，說明二次多元回歸模型極顯著；感官評分回歸模型失擬性檢驗P=0.362 9＞0.05，可以認為所選脫乳清風味調料乳感官評分二次回歸模型與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著。脫乳清風味調料乳感官評分回歸診斷表明，決定系數R2=84.10%，說明脫乳清風味調料乳感官評分的變化有84.10%源于凝乳酶添加量、白砂糖添加量、發酵時間和乳清蛋白粉添加量；信噪比=7.301，這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于脫乳清風味調料乳感官評分評價。離散系數C.V為標準差與均值的比值，表示試驗本身的精確度，C.V值越低，試驗的可靠性越高[22]，本試驗產品感官評分擬合C.V值為3.62%，可靠性較高。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確的分析和預測脫乳清風味調料乳感官評分，說明試驗操作可信度高，具有一定的實踐指導意義。由回歸系數顯著性表明，在所取因素水平范圍內，各因素對脫乳清風味調料乳感官評分影響的順序為：發酵時間（C）＞凝乳酶添加量（A）＞白砂糖添加量（B）＞乳清蛋白粉添加量（D）。

2.3.3 響應面優化

圖6～圖8是響應面變化三維曲面，可直觀地反映脫乳清風味調料乳中凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發酵時間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）交互作用對感官評分的影響。當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[23-24]。

圖6 凝乳酶添加量、白砂糖添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.6 Effect of the amount of rennin added and white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

圖7 白砂糖添加量、乳清蛋白粉添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.7 Effect of the amount of white sugar added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖6～圖8可知，A與B，B與D，A與D之間對脫乳清風味調料乳感官評分影響較大。脫乳清風味調料乳感官評分隨脫乳清風味調料乳凝乳酶添加量及白砂糖添加量的增加而呈先上升后降低的趨勢，凝乳酶添加量及白砂糖添加量為0.4%及4%時，脫乳清風味調料乳的感官評分值最大，與單因素和方差分析結果相符；由圖7可知，脫乳清風味調料乳感官評分隨脫乳清風味調料乳白砂糖添加量和乳清蛋白粉添加量的增加而呈逐漸升高后下降的趨勢，白砂糖添加量及發酵時間為4%及0.6%時，脫乳清風味調料乳的感官評分值最大，交互作用顯著和方差分析結果一致；由圖8可知，脫乳清風味調料乳感官評分隨著脫乳清風味調料乳凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量的增加感官評分呈先上升后降低的趨勢，凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量為0.4%及0.6%時，脫乳清風味調料乳的感官評分值最大，與單因素和方差分析結果一致。

2.3.4 最佳條件確定和回歸模型驗證

回歸模型通過響應面分析法得到最優脫乳清風味調料乳工藝條件，并根據設備情況對相關參數進行調整，對脫乳清風味調料乳最佳工藝條件進行驗證試驗，結果如表5所示。

圖8 凝乳酶添加量、乳清蛋白粉添加量對脫乳清風味調料乳感官品質的影響Fig.8 Effect of the amount of rennin added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

表5 脫乳清風味調料乳最佳工藝條件驗證Teble 5 Verification of the optimum technological conditions for de-whey flavor seasoning fermented milk

由表5可知，回歸模型通過響應面法得到最優脫乳清風味調料乳工藝條件為凝乳酶添加量0.41%，白砂糖添加量3.87%，發酵時間14.4 h，乳清蛋白粉添加量0.58%。考慮實際操作情況與設備參數狀況，確定脫乳清風味調料乳最佳工藝條件為：凝乳酶的添加量0.4%，白砂糖添加量4%，發酵時間14 h，乳清蛋白粉添加量0.6%，在上述最佳條件下進行驗證試驗，得到脫乳清風味調料乳的感官評分值為86.15±1.37，與理論值85.250 3接近。

2.4 產品理化和衛生指標

產品理化和衛生指標見表6。

表6 理化和衛生指標Table 6 The chemical and health indicators

由表6可得出，脫乳清風味調料乳的酸度約為90°T、蛋白質含量約為7.79%、脂肪含量約為5.16%、黏度為 7 300 mPa·s、活菌數約為 3.8×107CFU/mL，大腸菌群未檢出，各項指標均符合GB 19302-2010《食品安全國家標準發酵乳》要求。

3 結論

本試驗采用直投式菌種作為脫乳清風味調料乳的發酵劑，通過單因素試驗及響應面優化脫乳清風味調料乳的最佳生產工藝條件為香辛料質量比為6∶5∶4 ∶2 ∶1（花椒油 12 g、辣椒油 10 g、海鹽 8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g）、凝乳酶添加量0.4%、白砂糖添加量4%、發酵時間14 h、乳清蛋白粉添加量0.6%。該條件下生產的產品各項理化指標為蛋白質含量7.79%、脂肪含量 5.16%、酸度 90 °T、黏度為 7 300 mPa·s、活菌數約為3.8×107CFU/mL，且產品色香味俱佳、蛋白質豐富、口感濃郁，且風味獨特、具有香辛料氣味。脫乳清風味調料乳的研究，為特色發酵乳產業的開發提供一定的理論應用參考。