HPLC-MS/MS法測定腌制食品中色素含量的預處理方法比較

鐘萍，陳鮮麗，羅威，*，李亞楠

（1.湛江幼兒師范專科學校，廣東湛江524084；2.嶺南師范學院基礎教育學院，廣東湛江524037；3.韶關學院醫學院，廣東韶關512026）

蘇丹紅I～IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B均為合成色素，既可用于石油、機油等化工產品的調色，也可用于皮革、紡織品或家具的涂染[1-2]。由于上述化合物的結構中均有偶氮結構，人體若長期接觸，會對肝、腎臟器產生強烈毒性作用，并有致癌風險[3-4]，因此國內外食品安全監管部門明確要求，不允許將其作為食品添加劑使用，因此建立高效、靈敏、準確的檢測方法，對相關食品的安全監管意義重大。

目前蘇丹紅I～IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B的檢測方法主要有紫外分光光度法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、高效液相色譜-質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[9-10]、氣相色譜法[11]及酶聯免疫檢測法[12]等。其中以HPLC法和HPLC-MS/MS法應用最為常見，但高效液相色譜法的靈敏度較低，且易受共存組分的干擾，而其與質譜聯用后，可克服上述缺點，具有靈敏度高、選擇性強且定性與定量準確等特點，利于排除液相色譜的假陽性結果，因而利用HPLCMS/MS法檢測腌制肉類食品中合成色素的研究被廣泛報道[13-15]，但不同預處理樣品方法對測定結果的影響，卻鮮有提及。因此，本研究分別采用液液萃取-凝膠滲透色譜（liquid liquid extraction-gel permeation chromatography，LLE-GPC）法、固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）和QuEChERS法預處理腌制肉類食品后，利用HPLC-MS/MS法測定合成色素的含量，從而為相關食品中合成色素的定量檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標準物質（純度≥90.0%）：上海安譜科學儀器有限公司；臘腸：市售；甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨、乙酸乙酯、環己烷、正己烷、二氯甲烷均為色譜純：德國默克公司；乙酸、無水硫酸鈉均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；硅膠（C18）填料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料、Bio-Beads S-X3填料：天津博納艾杰爾科技有限公司；試驗用水為高純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm）。

PL-GPC220凝膠滲透色譜儀、Agilent 1200高效液相色譜：美國安捷倫科技公司；API 4000四極桿質譜儀：美國PE公司；ME204電子天平：梅特勒-托利多公司；LG-22M高速冷凍離心機：四川蜀科儀器有限公司；FV64全自動氮吹濃縮儀：廣州得泰儀器科技有限公司；FRQ-1020超聲波清洗器：溫州百亞超聲設備有限公司；XH-D渦旋混合器上海冠森生物科技公司；HN-98IB組織勻漿機：上海達洛科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

1.2.1.1 混合標準儲備液配制

分別準確稱取蘇丹紅I、蘇丹紅II、蘇丹紅III、蘇丹紅IV、蘇丹紅G、蘇丹橙G和蘇丹紅7B標準物質10.0 mg（精確至0.000 1 g），共置于100 mL容量瓶內，用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻，即得0.1 mg/mL混合標準儲備液。

1.2.1.2 混合標準溶液配制

分別精密移取上述混合標準儲備液0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 mL，置于 100 mL 容量瓶內，用乙腈稀釋至刻度線定容、搖勻，配制成濃度為0.10、0.50、1.0、5.0、10.0 μg/mL的混合標準溶液，現用現配。

1.2.2 儀器工作條件

1.2.2.1 凝膠滲透色譜條件

凝膠色譜柱（400 mm×25 mm），填料為Bio-Beads S-X3（0.037 mm～0.075 mm）；淋洗液：乙酸乙酯-環己烷（1∶1，體積比）；流量：5.0 mL/min；進樣體積：5 mL。

1.2.2.2 液相色譜條件

Agilent Zorbax SB C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為 30 ℃；流量為 1.0 mL/min；進樣體積10 μL；流動相：流動相A為0.1%（體積分數）甲酸、流動相 B 為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min 60%B；6 min～8 min時，B線性升高至100%；10 min～12 min時B線性降低至60%后，保持8 min。

1.2.2.3 質譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式為正離子掃描模式；檢測方式為多反應監測模式（multi-reaction monitoring，MRM）；離子源溫度600℃；氣簾氣流量30 L/min；霧化氣流量40 L/min；輔助干燥氣流量50 L/min；噴霧電壓為5 200 V。

MRM監測模式下7種合成色素的特征離子及其它質譜參數見表1。

表1 7種合成色素的質譜參數Table 1 Optimal mass parameters for the seven kinds of synthetic colorants

1.2.3 LLE-GPC法

1.2.3.1 樣品制備

超市購置的臘腸食品，搗碎后混勻，置于組織勻漿機內，完全粉碎制得供試樣品。

1.2.3.2 待測物提取

準確稱取粉碎完全后的樣品2.0g（精確至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯離心管內，精密移取20 mL乙酸乙酯-環己烷（1∶1，體積比），搖勻后渦旋振蕩15 min后，加入2 g無水硫酸鈉，繼續振蕩10 min后靜置至上層溶液澄清，離心7 min后（轉速：4 500 r/min），吸取上清液，重復上述步驟，合并兩次提取液，過0.45 μm濾膜，即得提取溶液。

1.2.3.3 GPC純化

精密移取提取溶液10 mL，采用1.2.2.1凝膠滲透色譜條件凈化1.2.3.2中提取液，收集22 min～28 min洗脫液后，于40℃氮氣濃縮蒸干，殘余物采用乙腈定容至1.0 mL，經0.22 μm濾膜過濾后，上樣至高效液相色譜串聯質譜儀中檢測。

1.2.4 SPE純化

精密移取提取溶液10 mL至活化后的Thermo SCX固相萃取柱，經50 mL正己烷淋洗去除油脂后，采用20 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，于40℃氮氣濃縮蒸干，采用乙腈定容至1 mL后，過0.22 μm濾膜，待測。

1.2.5 QuEChERS法

準確稱取粉碎完全后的樣品2.0g（精確至0.0001g），置于50 mL聚四氟乙烯離心管內，加入20 mL乙腈-水（1∶1，體積比），渦旋振蕩15 min后，加入2 g無水硫酸鈉，繼續振蕩 10 min，離心 7 min后（轉速：4 500 r/min），吸取上清液，重復上述步驟，合并兩次提取液后，精密移取10 mL，加入至裝有100 mg硅膠（C18）吸附劑的聚四氟乙烯離心管內，渦旋振蕩5 min后，離心5 min（轉速：4 500 r/min），吸取上清液，過 0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.6 基質干擾評價

為評估不同預處理方法的試驗條件對基質干擾的去除效果，在乙腈和空白臘腸中分別加入等體積1.0μg/mL的混合標準溶液，照公式：基質效應（ME/%）=|（A/B-1）｜×100，（式中：A為空白臘腸中色素的質譜響應強度；B為乙腈中色素的質譜響應強度）計算采用不同預處理方法試驗條件的基質效應。參考相關文獻評價標準[16]，當ME/%＜10%不存在基質干擾，10%＜ME/%＜20%時，為低程度干擾，20%＜ME/%＜50%時，為中程度干擾，ME/%＞50%時，則基質嚴重干擾目標化合物的測定。

2 結果與分析

2.1 不同化合物的色譜圖

根據7種合成色素的特征離子，在MRM監測模式下不同化合物的總離子流圖，見圖1，LLE-GPC法中凝膠滲透色譜分離，見圖2。

圖1 7種合成色素的總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of seven kinds of synthetic colorants

2.2 線性范圍與檢出限

圖2 GPC純化加標樣品色譜圖Fig.2 The Gel permeation chromatogram

采用標準加入法，利用HPLC-MS/MS法測定不同質量濃度的混合標準溶液，以質譜響應強度（y）作縱坐標，7種合成色素的質量濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，同時以3倍信噪比（S/N）為檢測限，以10倍信噪比（S/N）為定量限，得到不同分析物在一定線性范圍下的回歸方程、相關系數及檢測限與定量限，結果見表2。

2.3 LLE-GPC法條件優化

2.3.1 提取溶劑選擇

提取溶劑對目標化合物的提取效率直接影響測定結果的準確度，為保證樣品中目標化合物完全富集，選擇不同提取溶劑，照1.2.3.2步驟，分別萃取1.2.6中樣品溶液，考察正己烷、環己烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯-環己烷（1∶1，體積比）和乙酸乙酯-正己烷（1∶1，體積比）對基質效應的影響，結果發現，不同提取溶劑的ME/%均低于10%，但考慮后續凝膠色譜凈化的洗脫液為乙酸乙酯-環己烷（1∶1，體積比），因此確定乙酸乙酯-環己烷（1∶1，體積比）為提取溶劑。

表2 線性范圍、線性回歸方程、方法檢測限與定量限Table 2 Linear ranges，linear regression equation，limit of detection and limit of quantitation

2.3.2 提取次數選擇

提取次數間接反映提取效率，照1.2.3.2步驟，分別考察提取次數對基質效應的影響，結果發現，樣品溶液經兩次提取后，對不同色素的基質效應可降低至5%以下，因此確定提取次數為兩次。

2.4 SPE法條件優化

2.4.1 固相萃取柱選擇

固相萃取需利用固相萃取柱選擇性吸附目標化合物，經液相淋洗除雜后，再選擇性洗脫待測組分，從而實現待測物的分離、凈化與富集，因此選擇不同類型固相萃取柱，照1.2.3.2步驟，分別處理1.2.6中樣品溶液，考察 Dikma ProElut Silica、Agilent Bond Elut PSA、Thermo SCX固相萃取柱對基質效應的影響，結果見圖3。

圖3 固相萃取柱對基質效應的影響Fig.3 The effect of solid phase extraction column on matrix effect

從圖3可知，相較其它兩種固相萃取柱，采用Thermo SCX固相萃取柱的基質效應可降低至10%以下，這歸因于待測7種合成色素的化學結構中均存在苯環偶氮結構，易形成季銨鹽陽離子，構成π-π共軛穩定體系，而Thermo SCX固相萃取柱的固定相為苯磺酸基，具有強陽離子交換作用[17]，因此對上述合成色素均有較好保留，從而可有效去除基質干擾，因此選擇采用Thermo SCX固相萃取柱。

2.4.2 洗脫劑選擇

提取溶液上樣至固相萃取柱后，經正己烷洗滌去除油脂、蛋白質和非極性的雜質后，采用洗脫劑選擇性洗脫待測組分，因此考察等體積的不同洗脫劑（甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷）對基質效應的影響，結果發現，與其它洗脫劑相比，二氯甲烷對目標化合物檢測的基質效應，可降至最低，因此采用二氯甲烷作為洗脫劑。

2.5 QuEChERS法條件優化

2.5.1 提取劑選擇

由于7種合成色素的水溶性較好，化學性質相近，因此分別選擇等體積的不同溶劑（乙腈、乙腈-水（1∶1，體積比）、水、甲醇、甲醇-水（1∶1，體積比））作為提取劑，照1.2.5步驟，預處理1.2.6中樣品溶液，考察對基質效應的影響，結果發現，當采用乙腈-水（1∶1，體積比）提取時，對7種合成色素檢測的平均基質效應最低（4.7%），這可能歸因于乙腈-水（1∶1，體積比）提取目標物和其它極性雜質后，加入無水硫酸鈉發生鹽析效應，促使乙腈與水分層，從而除去溶于水相的蛋白質、糖分等雜質[18]，因此選用乙腈-水（1∶1，體積比）作為QuEChERS法預處理的提取劑。

2.5.2 吸附劑選擇

QuEChERS法常用 C18、N-丙基乙二胺（PSA）作為吸附劑，以去除提取溶劑中的糖類和蛋白質，因此分別照1.2.5步驟，預處理1.2.6中樣品溶液，考察不同種類與用量的吸附劑對基質效應的影響，結果見圖4。

圖4 吸附劑對基質效應的影響Fig.4 The effect of adsorbent on matrix effect

從圖4可知，當吸附劑為PSA時，樣品基質對合成色素檢測時干擾較小，7種色素的平均基質效應為5%左右，而C18相對較高，可能歸因于對部分色素具有一定吸附作用，另外隨著PSA用量的增多，平均基質效應降低并不明顯，因此選擇100 mg PSA作為QuEChERS法預處理的吸附劑。

2.6 不同預處理方法結果的準確度與精密度

為考察3種預處理方法結果的準確度與精密度，采用回收率表示結果準確度，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示結果的精密度，分別照1.2.3、1.2.4和1.2.5所述步驟，預處理3個水平（0.50、1.0、5.0 μg/mL）的加標樣品，進行回收試驗，每個水平平行測定5次，結果見表3。

表3 不同預處理方法的測定結果回收率與相對標準偏差（n=5）Table 3 The average recoveries and RSDs of results in different pretreatment methods（n=5）

從表3可知，SPE法的不同濃度水平的平均回收率在70%～110%之間，而QuEChERS法與LLE-GPC法的不同濃度水平的平均回收率均在90%～110%之間，優于SPE法，這可能歸因于提取溶液在固相萃取時，未被完全洗脫，3種方法的相對標準偏差均低于5%。與LLE-GPC法、SPE法相比，QuEChERS法的提取、除雜、純化過程簡便、快速，且無需昂貴的儀器與耗材，因而綜合預處理效率較高，適于相關產品的快速檢測。

3 結論

采用液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法和QuEChERS法預處理腌制肉類食品后，利用高效液相色譜-質譜法同時測定其合成色素的含量，固相萃取法的不同濃度水平的平均回收率在80%～110%之間，而QuEChERS法與液液萃取-凝膠滲透色譜法的不同濃度水平的平均回收率均在90%～110%之間。與液液萃取-凝膠滲透色譜法、固相萃取法相較，QuEChERS法預處理樣品的操作更為簡便、快速，且處理成本適中，綜合預處理效率較高，因此適用于腌制肉類食品中合成色素的測定。