蟛蜞菊總黃酮的超聲波輔助提取工藝優化及其抗氧化能力的研究

杜麗娟，蘇秀芳，冼金明

（廣西民族師范學院生物與食品工程學院廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地，廣西崇左532200）

蟛蜞菊[Wedelia chinensis（Osbeck）Merr.]又叫黃花蟛蜞草、黃花墨菜、黃花龍舌草、田黃菊、鹵地菊，屬于菊科蟛蜞菊屬的植物，主要生長在我國的廣東、廣西等亞熱帶地區[1]。據研究發現，蟛蜞菊具有較好的藥用價值，全草入藥[2]，現臨床主要用于治療肝炎、口腔炎等[3]，這和蟛蜞菊富含的植物活性成分密切相關。沈卓豪等[4]研究發現了蟛蜞菊花揮發油富含多種倍半萜類化合物，對大腸桿菌等6種細菌具有抑制作用；任慧等[5]從蟛蜞菊中分離出9種酚酸類化合物；孫小茗等[6]研究發現蟛蜞菊內酯對對乙酰氨基酚引起的急性肝損傷有明顯的保護作用；陳秀清等[7]對比4種蟛蜞菊葉蛋白的提取方法，但關于蟛蜞菊的活性成分總黃酮提取研究尚未見報道，許永[8]發現黃酮類化合物具有抑菌、消炎、抗氧化等多種功效。

超聲輔助提取技術被視為“綠色技術”，是一種高效、環保的提取技術，常用于提取熱不穩定性的成分，如Sun Xiaoyang等[9]利用超聲輔助提取花生蛋白，發現該方法能有效改善花生的乳化性；Luis等[10]發現超聲輔助提取藤黃總黃酮可使提取率提高3倍以上；Li Yuanhui等[11]將超聲輔助提取技術應用葛根淀粉，得到高純度的葛根淀粉。葉紅玲等[12]采用超聲輔助法提取藍莓花青素，李海燕等[13]確定了當歸多糖的最佳提取工藝。為了使蟛蜞菊的資源能夠得到充分的利用，本試驗選取蟛蜞菊為原料，以蟛蜞菊的主要有效活性成分黃酮類化合物的提取作為出發點，對于蟛蜞菊的黃酮類化合物的提取工藝進行了初步的研究，并做了抗氧化活性的測定，為進一步對蟛蜞菊的黃酮類化合物的研究和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟛蜞菊：采自廣西崇左市。

蘆丁、N-1-萘乙二胺鹽酸、無水磷酸氫二鈉：國藥集團化學試劑有限公司；DPPH（純度≥97%）：上海藍季科技發展有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、一水檸檬酸：成都市科龍化工試劑廠；硫酸亞鐵、水楊酸（純度為99.5%）、無水對氨基苯磺酸：天津市光復精細化工研究所；雙氧水、石油醚、無水乙醇、抗壞血酸：天津市北辰方正試劑廠；以上試劑均為分析純。

UV-16001超聲波清洗儀：上海冠特超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵：河南省予華儀器有限公司；VIS-7220N可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；AR124CN電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；HZ-2A恒溫水浴鍋：南京南大萬和科技有限公司；101電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫療儀器有限公司；GS-3008粉碎機：廣東佛山市南海家樂仕電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮提取

參照許建本等[14]的提取方法對蟛蜞菊總黃酮進行提取。

1.2.2 單因素試驗

設置料液比 1 ∶20（g/mL），超聲功率 50 W，提取時間20 min，提取溫度60℃，其他參數和操作同方法1.2.1，探究不同的乙醇濃度（35%、40%、45%、50%、55%）對總黃酮得率的影響。

設置乙醇濃度為45%，超聲功率50 W，提取時間20 min，提取溫度60℃，其他參數和操作同1.2.1，探究不同的料液比[1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]對總黃酮得率的影響。

設置乙醇濃度為45%，料液比1∶35（g/mL），提取溫度60℃，提取時間20 min，其他參數和操作同方法1.2.1，探究不同的超聲功率（30、40、50、60、70 W）對總黃酮得率的影響。

設置乙醇濃度為45%，料液比1∶35（g/mL），超聲功率50 W，提取溫度60℃，其他參數和操作同方法1.2.1，探究不同的提取時間（20、30、40、50、60 min）對總黃酮得率的影響。

設置乙醇濃度為45%，料液比1∶35（g/mL），超聲功率50 W，提取時間40 min，其他參數和操作同方法1.2.1，探究不同的提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對總黃酮得率的影響。

1.2.3 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度、料液比、超聲功率、提取時間這4個因素的3個水平，在最佳溫度60℃下進行L9（34）正交試驗，以確定蟛蜞菊的總黃酮最佳提取工藝。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 The design for orthogonal test of four factors at three different levels

1.2.4 總黃酮得率的測定

參照Aadil等[15]的測定方法。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 DPPH·清除能力的測定

參照許建本等[14]的測定方法。

1.2.5.2·OH清除能力的測定

參照馬玲龍等[16]的測定方法。

1.2.5.3 NaNO2清除能力的測定

參照王敏等[17]的測定方法。

1.2.6 重復性試驗

由正交試驗得出蟛蜞菊總黃酮的最優提取方案后，在最優方案下重復提取3次，在波長為510 nm處測出吸光度值，算出提取率，并進一步計算其平均值，對最佳工藝進行驗證。

1.2.7 加標回收試驗

準確移取4份0.50 mL在最優方案條件下得到的蟛蜞菊總黃酮提取液，分別移入25 mL的比色管中，其中有3份分別加入0.5 mL的蘆丁標準溶液（0.40 mg/mL），接著按步驟1.2.4進行操作，在波長為510 nm處測吸光度值，并根據吸光度數值計算出加標回收率。其計算公式如式（1）。

1.3 數據處理

所有試驗數據重復測定3次以上，采用Origin8.5、SPSS19.0軟件進行圖片繪制和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對蟛蜞菊總黃酮得率的影響

乙醇濃度對蟛蜞菊總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增大，蟛蜞菊總黃酮得率呈先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為35%時，黃酮得率最低，為6.83%，當乙醇濃度為45%時，黃酮得率呈現最大值，為7.49%，改變乙醇濃度可提高黃酮得率，提高了9.66%。當乙醇濃度超過45%時，蟛蜞菊總黃酮得率出現下降趨勢，這可能和蟛蜞菊黃酮的主要成分有較大關系，眾所周知，黃酮是一大類以2-苯基色原酮為基本母核的化合物，其溶解度與結構和存在狀態密切相關。當乙醇濃度為45%時，有利于蟛蜞菊總黃酮的溶解，因此得率最高。

2.1.2 料液比對蟛蜞菊總黃酮得率的影響

料液比對蟛蜞菊總黃酮得率的影響見圖2。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on total flavonoids yield

由圖 2 可知，當料液比為 1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL），隨著溶劑體積的增大，蟛蜞菊總黃酮得率不斷升高，從7.14%到7.34%，當溶劑體積大于35倍時，黃酮得率開始降低，這一變化趨勢和其他學者的研究結果一致，如荊常亮[18]研究發現溶劑體積在一定范圍內的增加有利于黃酮類化合物的溶出，主要是因為溶劑體積的增大會增加有效成分與溶劑的接觸機會，從而有助于黃酮類化合物的溶出。因此蟛蜞菊總黃酮提取的最佳料液比為 1 ∶35（g/mL）。

2.1.3 超聲功率對蟛蜞菊總黃酮得率的影響

超聲功率對蟛蜞菊總黃酮得率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of power on total flavonoids yield

由圖3可知，在超聲功率為30 W到50 W之間時，蟛蜞菊總黃酮得率不斷升高，在超聲功率為50 W的時候黃酮得率最高，高達7.29%。當超聲功率大于50 W時，隨著超聲功率的增加，黃酮得率呈輕微下降的趨勢，可能是因為超聲功率較大時對黃酮類物質有所破壞。由此可見蟛蜞菊總黃酮的最佳超聲功率為50 W。

2.1.4 提取時間對蟛蜞菊總黃酮得率的影響

提取時間對蟛蜞菊總黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on total flavonoids yield

由圖4可知，在提取時間為20 min～40 min之間時，蟛蜞菊總黃酮得率不斷升高，但在提取時間大于40 min后，蟛蜞菊總黃酮得率急劇降低，這說明當提取時間為40 min時，黃酮基本被提取出來了，后續再增加提取時間，黃酮物質不再增加。因此總黃酮的最佳提取時間為40 min。

2.1.5 提取溫度對蟛蜞菊總黃酮得率的影響

提取溫度對蟛蜞菊總黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on total flavonoids yield

由圖5可知，隨著提取溫度的增加，蟛蜞菊總黃酮得率不斷增加，但當提取溫度大于50℃時，黃酮得率增加速度變得緩慢，并在60℃后出現了下降趨勢。一般情況下，環境溫度越高，分子運動越快，分子擴散和滲透作用加強，因此黃酮溶出量增加，但當溫度過高會破壞部分黃酮物質，從而導致黃酮得率下降，這一點和劉香萍等[19]的研究一致。綜合考慮，選60℃為最佳提取溫度。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取乙醇溶液的濃度、料液比、超聲功率、提取時間4個影響因素。按照表1設計L9（34）正交試驗，得出蟛蜞菊總黃酮得率，結果見表2。方差分析見表3。

表2 蟛蜞菊總黃酮提取正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total flavonoids from Wedelia chinensis

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

由表2和表3可知，在提取溫度為60℃的條件下，影響蟛蜞菊中總黃酮得率的主次因素為A＞C＞D＞B，即提取時間＞乙醇濃度＞料液比＞超聲功率，提取時間、乙醇濃度和料液比這3個因素對蟛蜞菊中總黃酮得率有極顯著影響。從正交優化試驗可以得出提取蟛蜞菊總黃酮的最佳工藝條件為A2B1C2D1，即提取時間40 min、超聲功率為40 W、乙醇濃度45%、料液比1 ∶30（g/mL）。

按最佳提取工藝條件：提取溫度60℃、提取時間40 min、超聲功率為40 W、乙醇濃度45%、料液比1∶30（g/mL），進行3次平行試驗，測得黃酮得率平均值為6.896%，3組試驗數據相差較小，表明正交試驗優選得出的工藝條件具有可靠性。

精密移取4份蟛蜞菊總黃酮提取液0.50 mL，其中3份分別加入0.50 mL的蘆丁標準溶液（0.40 mg/mL），以乙醇為空白對照，按1.2.7步驟進行操作，3組試驗得到的回收率結果分別為101%、100%、98.1%，得到平均回收率為99.7%，RSD值為2.9%，表明此方法準確可靠。

2.3 抗氧化能力的測定

2.3.1 蟛蜞菊總黃酮對DPPH·清除能力的測定

蟛蜞菊總黃酮對DPPH·的清除能力見圖6。

圖6 蟛蜞菊總黃酮對DPPH·的清除能力Fig.6 The DPPH·scavenging ability of of total flavonoids in the Wedelia chinensis

由圖6可以得出，隨著蟛蜞菊總黃酮和抗壞血酸的濃度不斷提高，DPPH·的清除能力呈上升趨勢，當蟛蜞菊總黃酮濃度低于0.5 mg/mL時，DPPH·的清除能力上升速度很快，當質量濃度為0.664 0 mg/mL時，DPPH·的清除能力達到了94.62%，與VC的DPPH·的清除能力96.72%相近，說明蟛蜞菊總黃酮在較大濃度時具有很強的清除DPPH·的能力。

2.3.2 蟛蜞菊總黃酮對·OH清除能力的測定

蟛蜞菊總黃酮對·OH的清除能力見圖7。

圖7 蟛蜞菊總黃酮對·OH的清除能力Fig.7 The·OH scavenging ability of of total flavonoids in the Wedelia chinensis

由圖7可以得出，隨著蟛蜞菊總黃酮和抗壞血酸的質量濃度不斷提高，·OH的清除能力呈上升趨勢，當蟛蜞菊總黃酮質量濃度較低時，·OH的清除能力上升速度很快，當濃度較高時，·OH的清除能力上升速度較慢，并趨于穩定的狀態。當質量濃度為0.664 0 mg/mL時，·OH的清除能力達到了76.29%，比同濃度的VC的·OH的清除能力98.98%低，說明蟛蜞菊總黃酮在較大濃度時具有一定的清除·OH的能力，但其清楚能力沒有抗壞血酸強。

2.3.3 蟛蜞菊總黃酮對NaNO2清除能力的測定

蟛蜞菊總黃酮對NaNO2清除能力見圖8。

圖8 蟛蜞菊總黃酮對NaNO2清除能力Fig.8 The NaNO2scavenging ability of total flavonoids in Wedelia chinensis to sodium nitrite

由圖8可以得出，隨著蟛蜞菊總黃酮和抗壞血酸的濃度不斷提高，NaNO2的清除能力呈上升趨勢，當蟛蜞菊總黃酮濃度較低時，NaNO2的清除能力也較低，低至24.07%。隨著質量濃度的提高，NaNO2的清除能力也逐漸增強，當蟛蜞菊總黃酮濃度為0.664 0 mg/mL時，NaNO2的清除能力達到了63.99%，比最低時提高了166%，說明一定濃度的蟛蜞菊總黃酮具有一定的NaNO2清除能力。

3 結論

本文以蟛蜞菊為研究對象，采用超聲波輔助提取蟛蜞菊總黃酮，并對其抗氧化能力進行探究，通過試驗發現總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度45%、料液比 1∶30（g/mL）、超聲功率 40 W、提取時間 40 min、提取溫度60℃，此條件下，蟛蜞菊總黃酮的得率高達6.896%。蟛蜞菊總黃酮提取液的質量濃度越大，對·OH、DPPH·以及亞硝酸鈉的清除能力就越強。當蟛蜞菊總黃酮的質量濃度為0.664 mg/mL時，對于DPPH·、·OH、NaNO2的清除率分別為 94.62%、76.29%、63.99%，即DPPH·的清除率＞·OH的清除率＞NaNO2的清除率，表明蟛蜞菊具有較強的抗氧化能力，具備了較高的藥用開發應用價值，可用做醫藥方面和抗氧化保健品的原料，開發成具有抗氧化作用的保健食品。