FSHR基因多態性與絕經后骨質疏松癥的關聯性分析

余麗金 許艷 崔紅旺 溫廣宇

1.海南現代婦女兒童醫院，海南 海口 570203 2.海南醫學院第一附屬醫院，海南 海口 570102

絕經后骨質疏松是一種多基因調控的遺傳性疾病，主要表現為骨脆性增加、骨組織微結構損壞、全身骨量降低[1]。骨質疏松病因與老齡化、環境、激素水平及遺傳等多種因素有關，其中婦女進入更年期后，雌激素缺乏會使骨生長落后于骨吸收速度，進而造成骨密度(bone mineral density，BMD)大量流失，最終導致骨質疏松[2]。骨質疏松發病率呈逐年增高趨勢，且極易造成骨折，對中老年人身心健康造成嚴重威脅[3]。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)是垂體前葉嗜酸性粒細胞分泌的一種激素，能促進卵泡成熟，與絕經前后女性骨代謝調節有密切聯系[4]。FSH受體(FSH receptor，FSHR)是FSH在體內發揮作用的主要途徑，FSHR基因多態性會使得FSH空間結構發生改變，進而影響FSHR與其配體相互作用，進一步引起受體信息傳遞發生改變，最終影響FSH發揮作用[5]。目前關于FSHR基因多態性與骨質疏松相關性的研究較少，因此，本研究通過對FSHR基因外顯子10上680位的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)進行探究，進而探討FSHR基因多態性與絕經后骨質疏松癥的關聯性，以期為臨床合理防治絕經后女性發生骨質疏松癥提供一定理論依據，降低骨折發生幾率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月至2019年3月因骨質疏松于本院骨科住院的136例絕經后女性患者為研究對象(骨質疏松組)，平均年齡(62.87±6.12)歲；同期選取118例絕經后非骨質疏松女性作為對照(對照組)，平均年齡(64.23±9.24)歲。

收集患者入院時一般資料，包括年齡、絕經期年齡、絕經期年限、體質量指數(body mass index，BMI)、糖尿病、高血壓等。骨質疏松患者納入標準：①均符合中國人骨質疏松癥診斷標準專家共識中對骨質疏松癥的診斷標準[6]，診斷一般以骨密度下降、骨量減少及發生脆性骨折等為依據，發生脆性骨折即可診斷為骨質疏松，其中骨密度等于或低于同性別年輕健康成人骨密度峰值2.5個標準差(T-score≤-2.5 SD)；②絕經年齡≥40歲者；③無心腦血管等并發性疾病；④臨床病理資料完整、清晰者。排除標準：①繼發性骨質疏松者；②長期服用抗癲癇藥物、雌激素、維生素D、肝素等影響骨代謝藥物者；③伴有影響骨代謝疾病者，如骨腫瘤及營養不良；④伴有其他低骨量疾病者。本研究中所有患者均由兩名及以上主治醫師明確診斷。本研究經本院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試對象及家人均由專業人員詳細告知研究內容后自愿參加，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(型號：DK604)，購自上海萊楓生物科技有限公司；PCR buffer Set(PCR buffer及MgCl2稀釋液)(型號：11160010-1)，購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；血清骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA試劑盒(型號：YM-QP11447)，購自上海遠慕生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)ELISA試劑盒(型號：SBJ-H1342)，購自南京森貝伽生物科技有限公司。UVP8000型凝膠成像分析系統，購自美國Millipore公司；HLC-723G8型全自動糖化血紅蛋白分析儀，購自上海東曹生物科技有限公司；FAITH-1600型全自動生化分析儀，購自杭州中翰盛泰醫療器械有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1樣品采集及保存：抽取兩組女性清晨空腹外周靜脈血樣兩份，其中一份置于含5% EDTA抗凝管中，用于提取外周血DNA；另一份置于促凝管中，經3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3.2骨代謝、糖代謝及BMD相關指標測定：TRACP-5b、BALP采用酶聯免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法測定；糖化血紅蛋白(HbA1c)采用全自動糖化血紅蛋白分析儀測定；空腹胰島素(FINS)采用全自動生化分析儀測定；BMD測定時所有研究對象均采取仰臥位，測定腰椎(L2～4)及左側股骨頸兩個部位，且均由同一技術人員操作。

1.3.3FSHR基因多態性檢測：參照DNA提取試劑盒說明書提取兩組女性外周血中DNA，核酸定量儀測定A260和A280，計算DNA純度和濃度，并將濃度稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存。PCR引物序列，上游：5‘GCAAGTGTGGCTGCTATGAA3’，下游：5‘GTGACATACCCTTCAAAGGC3’。反應體系共25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.8 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個循環。瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像儀分析，將單一明亮條帶的PCR產物送上海生工生物工程公司純化并測序，BLAST進行測序結果比對。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、絕經期年齡、絕經期年限、糖尿病患病比例、高血壓患病比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)；骨質疏松組BMI顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between the two groups

2.2 兩組骨代謝、糖代謝及BMD相關指標比較

兩組HbA1c、FINS比較，差異無統計學意義(P>0.05)；骨質疏松組TRACP-5b、BALP水平顯著高于對照組(P<0.05)，腰椎BMD、股骨頸BMD水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組骨代謝、糖代謝及BMD相關指標比較Table 2 Comparison of bone metabolism, glucose metabolism, and BMD related indexes between the two groups

2.3 兩組FSHR基因的SNP構成比較

結果顯示，FSHR基因外顯子10的680多態位點上有Asn680Asn(A/A)型(520 bp)、Asn680Ser(A/S)型(520 bp、413 bp、107 bp)、Ser680Ser(S/S)型(413 bp、107 bp)3種基因型(見圖1)，其中對照組基因型中A/A型(占62.71%)最多，其次為A/S型(占20.33%)，S/S型(占16.96%)最少；骨質疏松組基因型中以S/S型(占59.56%)為主，其次為A/A型(占28.68%)，A/S型(占11.76%)最少。兩組基因型比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組FSHR基因的SNP構成比較[n(%)]Table 3 Comparison of SNP composition of FSHR genes between the two groups [n(%)]

圖1 680多態位點基因型檢測Fig.1 Genotype detection of 680 polymorphism注：M：DNA laddar；1：A/A型；2：A/S型；3：S/S型

2.4 影響骨質疏松發生的多因素分析

將骨質疏松是否發生作為因變量，以FSHR的3種基因型(A/A型、A/S型、S/S型)、BMI、TRACP-5b、BALP、腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示S/S型基因型、BMI是影響骨質疏松發生的獨立危險因素，腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD是影響骨質疏松發生的保護因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響骨質疏松發生的多因素分析Table 4 Multiple analysis of factors influencing osteoporosis incidence

3 討論

骨質疏松是一種骨質流失導致骨骼脆性增加的代謝性骨骼疾病，正常骨代謝周期中，成骨細胞不斷形成新骨和破骨細胞，且不斷吸收舊骨，構成動態平衡，當平衡打破時，骨形成速率低于破骨細胞的骨吸收速率，最終導致骨質疏松，患者有較高的骨折風險，且多發于絕經后女性群體中[7]。目前臨床骨質疏松的診斷主要依靠BMD檢查和臨床癥狀，但BMD出現改變需6個月甚至1年以上時間，因此不能通過測定BMD值反映早期骨質疏松改變[8]。因此尋找一些與骨質疏松關聯性較強的檢測指標，可能比BMD檢測更能快速地評估骨質疏松，且對防治女性絕經后發生骨質疏松有重要意義。

FSH是垂體前葉嗜酸性細胞合成并分泌的一種促性腺激素，FSH是維持卵泡發育、成熟的必需物質，同時也是最終引發排卵的重要物質[9]。而FSH只有通過卵泡顆粒的相應受體即FSHR介導才能進入靶細胞內發揮其作用，FSHR由胞外區、跨膜區及C-末端區構成，是G蛋白耦合受體超家族成員之一[10]。研究表明[11]，FSHR基因多態性與生殖有密切聯系，然而在絕經后女性體內的研究較少，且并無出現與骨質疏松相關的研究。但目前有許多探究相關基因多態性與絕經后女性骨質疏松癥關系的研究。馬秋華等[12]研究發現，Klotho基因G395 A基因型GG在骨量正常組老人中分布頻率顯著高于骨質疏松組老人，可能與骨質疏松癥有關。本研究結果顯示，FSHR基因外顯子10的680多態位點上有Asn680Asn(A/A)型、Asn680Ser(A/S)型、Ser680Ser(S/S)型3種基因型，其中對照組基因型中A/A型(占62.71%)最多，S/S型(占16.96%)最少；骨質疏松組基因型中以S/S(占59.56%)為主， A/S型(占11.76%)最少，兩組基因型比較，差異有統計學意義。提示S/S純合子基因型與骨質疏松可能有關，FSHR基因型的檢測可能作為預測絕經后女性骨質疏松癥的一項補充指標。

骨代謝指標TRACP-5b來源于破骨細胞，是一種反映骨吸收狀況的指標[13]。BALP由成骨細胞生成，能夠進入血循環并參與骨形成[14]。腰椎BMD、股骨頸BMD是反映骨質疏松癥的有效指標，骨質疏松患者的骨折風險會隨BMD降低而升高[15]。本研究結果顯示，骨質疏松組TRACP-5b、BALP水平顯著高于對照組，腰椎BMD、股骨頸BMD水平顯著低于對照組。提示TRACP-5b、BALP、腰椎BMD、股骨頸BMD等指標與骨質疏松病情發生、發展密切相關，可以作為預測骨量減少、骨質疏松的參考指標。進一步研究發現，兩組年齡、絕經期年齡、絕經期年限、糖尿病患病比例、高血壓患病比例比較，差異無統計學意義；骨質疏松組BMI顯著低于對照組。提示較高BMI值可能對機體起到保護作用，減少骨質疏松發生。Logistic回歸分析，結果顯示S/S型基因型、BMI是影響骨質疏松發生的獨立危險因素，腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD是影響骨質疏松發生的保護因素。提示臨床上可通過檢測FSHR基因型，初步預測骨質疏松癥發生。進一步提示老人需進行健康的生活方式、合理膳食、控制BMI值，減慢骨量的丟失速度，延緩并減少骨質疏松發生。

綜上所述，FSHR基因多態性與女性絕經后骨質疏松發生有密切聯系，臨床上可通過檢測FSHR基因型，對骨質疏松做出初步預測，以便盡早干預和控制，對預防原發性骨質疏松發生具有重要價值，同時為臨床治療骨質疏松開辟新思路和視野，但具體作用機制仍需進一步研究。