2型糖尿病腎病并發骨質疏松大鼠模型研究

劉明明 呂南寧 許海燕 華臻 馬勇 黃桂成 程建

1.連云港市第二人民醫院，徐州醫科大學連云港臨床學院，江蘇 連云港 222000 2.徐州醫科大學，江蘇 徐州 221000 3.南京中醫藥大學骨傷研究所，江蘇 南京 210000 4.南京中醫藥大學附屬徐州市中心醫院，江蘇 徐州 221000

隨著經濟的快速發展，人們的生活水平、飲食結構得到了明顯的改變，因而老年性相關的慢性代謝性疾病如2型糖尿病、骨質疏松癥等的發病率也隨之增加，這不僅降低了廣大中老年人生活質量，也給社會帶來了沉重的經濟負擔。我國作為世界第一人口大國，2型糖尿病的患病率在2017年統計已達10.4%，慢性微血管是2型糖尿病患者最常見的并發癥，而糖尿病腎病又是對糖尿病患者影響最大的慢性微血管疾病，其發病率高達20%左右[1]。糖尿病腎病不僅是終末期腎病的最主要原因[2]，同時也是糖尿病患者死亡的最重要原因[3-4]。大量的臨床研究發現糖尿病腎病患者常常合并有骨質疏松癥，其特征主要是各種原因導致的骨礦物質密度下降，骨骼強度受損，以及受到輕微外力即發生骨折，威脅著全世界數百萬中老年人的健康與生活[5-6]。所以鑒于糖尿病腎病的高發病率以及嚴重危害中老年人的健康，其與骨質疏松癥之間的關系愈來愈受到人們的關注。然而目前卻鮮有對于糖尿病腎病并發骨質疏松的發病機制的研究，也沒有明確療效的治療手段來阻逆它的進展。因此建立成功的2型糖尿病腎病并發骨質疏松的動物模型對于研究糖尿病腎病并發骨質疏松的發病機制及治療手段具有重要的意義。然而，目前卻缺少對糖尿病腎病并發骨質疏松的動物模型的建立方法與評價標準的研究，本文主要是研究糖尿病腎病并發骨質疏松的動物模型的建立方法以及對建模成功的衡量標準進行探討，旨在為研究糖尿病腎病并發骨質疏松的發病機制及治療手段提供基礎依據。

1 材料和方法

1.1 造模動物及試劑

此次研究實驗于2018年6月至2019年5月在徐州醫科大學動物實驗中心、連云港市第二人民醫院完成。實驗前已得到徐州醫科大學動物實驗倫理審批。

動物信息：隨機選擇雄性SD大鼠共70只，大鼠體重保持在(200±20) g，由徐州醫科大學動物實驗中心提供，合格證號：蘇SYXK2008-0034。

試劑：鏈脲佐菌素(STZ)來自于calbiochem公司購買。由徐州醫科大學動物實驗中心統一配置高糖高脂喂養飼料，其配方采用目前實驗經典配方：常規飼料66．5%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：將70只正常SD大鼠隨機分為2組，造模組50只，正常組20只。造模組予以高糖高脂飼料喂養，同時飲用12%果糖水。正常組予以普通飼料喂養，飲用正常自來水。4周后禁食12 h，造模組大鼠和正常組大鼠分別予以左下腹一次性注射鏈脲佐菌素(35 mg/kg)和檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L)。兩組注射完成后繼續喂養4周，每周觀察兩組大鼠的尿量、進食量、飲水量、血糖以及體重。實驗結束時造模組大鼠血糖<16.7 mmol/L、尿糖為陰性、尿蛋白定量<20 mg/24 h予以剔除，不計入統計[7-8]。

1.2.2骨密度：使用乙醚吸入式全身麻醉對兩組大鼠進行全身麻醉，將麻醉后大鼠平躺于雙能X射線骨密度儀(DXA)探頭下，測量全部大鼠的骨密度(全身和左股骨)。

1.2.3生物力學實驗檢測骨強度：通過載荷-變形曲線可以獲得股骨的結構力學參數，通過應力-應變曲線可以獲得股骨的材料力學參數。采用股骨三點彎曲實驗方法，記錄載荷-變形曲線與應力-應變曲線。取出各組左側股骨，去除股骨表面附著的軟組織，各標本在制作過程中均用生理鹽水紗布包裹。然后進行股骨生物力學測試，分別記錄股骨的載荷-變形與應力-應變曲線。

1.2.4血及尿標本觀察指標：通過代謝籠收集大鼠24 h尿液，并進行24 h尿蛋白定量及尿肌酐(Ucr)等相關指標檢測。內眥取血，測定血肌酐(Scr)。依公式：Ccr=Ucr×24 h尿量/Scr計算Ccr。無水乙醚吸入麻醉后，開胸取心臟血，測定AST、ALB、ALT等生化指標。采用分光光度法和ELISA法測定大鼠血清中骨代謝相關指標：血Ca、血P、TALP、TRAP的變化。

1.2.5腎肥大指數：全部大鼠取雙腎，用電子天平稱重，腎肥大指數=腎重/體重。

1.2.6普通光鏡觀察：取大鼠右腎組織，固定在10%中性福爾馬林液中，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片，脫蠟水化，并進行HE染色，然后使用普通光學顯微鏡觀察大鼠腎組織形態結構等。取大鼠股骨，剔除多余肌肉等軟組織，將其固定甲醛(4%)溶液中，然后置于脫鈣液(水楊酸、蒸餾水、36%鹽酸、冰醋酸、)中脫鈣48 h。沿股骨矢狀面切成5 μm薄片，并進行HE染色。光學顯微鏡下，觀察骨組織形態學變化。

1.3 數據分析

應用軟件SPSS 13.0進行數據分析，數據使用平均值±標準誤的形式表示，如果組間比較則采用獨立樣本t檢驗分析，對于多樣本間比較則用方差分析方法，常規組間差異以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

正常組大鼠飲食、飲水無異常，大小便正常，精神狀態良好，活潑健壯，毛發有光澤，體重隨著周數的增加而增加，無死亡。造模組自注射鏈脲佐菌素2周后，大鼠明顯表現為精神萎靡，反應遲鈍，多飲、多食、多尿、體毛松散，活動減少，動作遲緩，部分出現腹瀉，便秘、腸梗阻的交替癥狀。實驗過程中，造模組1只大鼠因血糖不達標被剔除，3只因尿蛋白不達標被剔除。另外，造模組在腹腔注射鏈脲佐菌素成功后的4周內先后有4只死亡，最后在第8周造模組成功造模糖尿病腎病并發骨質疏松大鼠模型42只，造模成功率為84%。

2.2 體重、進食量、飲水量、腎重及腎肥大指數比較

建模之前，兩組大鼠間體重、進食量及飲水量差異無明顯差異性(P>0.05，見表1)，喂養8周建模成功后，造模組大鼠體重明顯低于正常對照組，造模組相較于正常組進食量與飲水量大幅度升高，差異有明顯統計學意義(P<0.01，見表1)。并且造模組腎臟肥大明顯，腎肥大指數顯著高于正常組，差異有明顯統計學意義(P<0.01，見表2)。

表 1 兩組大鼠實驗前后的體重、進食量及飲水量比較Table 1 Comparison of body weight, food intake, and water intake between the two groups before and after the experiment

表2 兩組大鼠第8周腎重及腎肥大指數比較

2.3 血糖、24 h尿量及尿蛋白的改變

實驗前兩組大鼠的血糖、24 h尿量及尿蛋白比較無明顯差異性(P>0.05，見圖1～3)，造模組予以高糖高脂喂食后，造模組的血糖及24 h尿量、尿蛋白逐漸增加，每2周所測得的血糖及24 h尿量、尿蛋白均較正常組增高，其差異有統計學意義(P<0.05)。4周后造模組予以STZ注射后，造模組的血糖及24 h尿量、尿蛋白異常增高。

圖1 兩組大鼠不同時間段的血糖比較Fig.1 Comparison of blood glucose between the two groups in different time periods

圖2 兩組大鼠不同時間段24 h尿量比較Fig.2 Comparison of 24 h urine volume between the two groups in different time periods

圖3 兩組大鼠不同時間段24 h尿蛋白量比較Fig.3 Comparison of 24 h urinary protein between the two groups in different time periods

2.4 兩組大鼠第8周血、尿生化指標的對比

第8周檢測兩組大鼠血Ca、P和尿Ca、P指標，造模組血Ca、P明顯低于正常組血Ca、P，差異有統計學意義(P<0.01，見表3)，且造模組尿Ca、P含量明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01，見表3)。

表3 兩組大鼠第8周血Ca、P和尿Ca、P比較

第8周檢測兩組血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)指標，造模組血清肌酐、血尿素氮明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01，見表4)，而造模組尿肌酐含量明顯低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 兩組大鼠第8周Scr、BUN、Ucr指標比較

第8周檢測兩組血清總堿性磷酸酶(TALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAR)指標，造模組TALP、TRAR明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01，見表5)。

表5 兩組大鼠第8周TALP、TRAR指標比較

2.5 生物力學及骨密度對比

第8周取各組左側股骨，測量兩組的生物力學指標，結果顯示造模組的極限載荷、彈性模量和彎曲強度均低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05，見表6)。

表6 兩組大鼠第8周左側股骨的極限載荷、彈性模量和彎曲強度指標對比

第8周采用雙能X線檢測兩組大鼠全身、股骨骨密度(見圖4)。與正常對照組大鼠相比，造模組大鼠的全身及左股骨骨密度均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表7)。

表7 兩組大鼠第8周全身及左股骨密度比較(g/cm2)

圖4 兩組大鼠X線掃描圖Fig.4 X-ray scan of rats in the two groups

2.6 大鼠腎、骨病理學觀測

正常組大鼠腎皮質區腎小球及腎小管形態基本正常；造模組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜基質擴張，腎小管出現空泡樣病變，足細胞足突大量融合，甚至脫落丟失。正常組大鼠骨小梁形態基本正常，骨小梁粗大、均勻，排列緊湊，互相連接成網格狀結構，并且骨髓腔清晰，形態規整。造模組大鼠顯微鏡觀察骨小梁明顯稀疏，小梁之間的間隙變大，小梁變細，數量減少，連續性中斷，常見游離斷增多，骨髓腔增大，且呈不規則形態。見圖5。

圖5 兩組大鼠腎、骨組織HE染色觀察Fig.5 HE staining observation of the kidney and bone tissue in rats of the two groups

3 討論

隨著糖尿病腎病患者的病程進展，高血糖產生的滲透性利尿，使尿中鈣、磷等排出增加，從而引起機體內骨代謝紊亂。長時間的尿糖升高會引起腎小管的病變，阻礙腎小管的重吸收，Ca、P排泄增多，血Ca、P減少，代償性的甲狀旁腺素分泌增多，增強破骨細胞活性，骨吸收增加，骨密度下降[9]。另一方面，糖尿病腎病患者體內增多的糖基化終末產物，促進成骨細胞的凋亡，導致骨合成不足，骨量減少，骨組織的細微結構發生改變，骨小梁數量逐漸變少、變細，并出現斷裂，導致骨質疏松癥的發生。

隨著目前2型糖尿病腎病并發骨質疏松的發病日益嚴峻，進一步防治該病，建立良好的2型糖尿病腎病并發骨質疏松的動物模型已經迫在眉睫。既往的傳統研究主要集中在2型糖尿病腎病的動物模型，而對于并發骨質疏松的2型糖尿病腎病的研究較少。傳統的2型糖尿病腎病動物模型的建立方法主要有3種，包括自發性、誘發性和轉基因動物模型。然而由于在自發性與轉基因動物模型發病過程中遺傳因素占據主導作用，這與臨床上糖尿病腎病的病理特點并不完全相符，且這種模型動物在我國來源有限、價格昂貴，極大地限制了相關研究的開展。誘發性動物模型中，三聯法(高能量飲食+STZ注射+單側或部分腎切除)雖然造模時間較短，具有顯著的生化、病理改變，但是存在操作復雜、容易感染、死亡率高的弊端[10]，因此，從價格、操作性、死亡率、成模率等方面考慮，誘發性動物模型中高能量飲食聯合STZ誘導的動物模型是目前較為理想的2型DN模型。高能量飲食(高糖、高脂、高糖高脂飼料)誘導胰島素抵抗，4周后再通過注射小劑量鏈脲佐菌素，從而破壞部分胰島β細胞，刺激胰島素分泌減少，從而形成2型糖尿病腎病模型[11]，此次實驗通過高能量飲食誘導胰島素抵抗，聯合鏈脲佐菌素破壞部分胰島β細胞，第8周時成功建立糖尿病腎病并發骨質疏松動物模型，成功率在84%。

臨床糖尿病腎病并發骨質疏松主要表現為持續的血糖、糖化血紅蛋白的升高，大量蛋白尿，并有飲水量多、尿量多和消瘦以及骨密度下降的癥狀。對于糖尿病腎病患者來說，尿蛋白的檢測是其診斷的金標準之一，研究發現通過減少糖尿病患者的尿蛋白的排泄可以減少或者延緩糖尿病腎病的發生和病程進展[12-13]。不論是DN還是其他類型的腎病，蛋白尿與腎病的進展密切相關[14-15]。微量蛋白尿不僅是早期腎損傷的信號，出現微量蛋白尿時往往代表著患者腎小球已出現了廣泛損傷，其出現可增加患者的死亡率[16]。本次實驗中造模組在高糖高脂喂食后，尿量和尿蛋白逐漸增加，在第4周利用鏈脲佐菌素注射進行誘導后，造模組大鼠的尿量和尿蛋白與對照組相比，均明顯增高。隨著糖尿病腎病大鼠的腎功能逐漸下降，在第6周后，造模組大鼠的腎臟逐漸發生衰竭，尿量逐漸下降。在第8 周末，造模組大鼠的尿素氮、肌酐升高，體重增長緩慢，并且骨密度以及骨骼生物力學檢測明顯下降，符合糖尿病腎病并發骨質疏松的臨床特點。最后病理組織染色顯示正常組大鼠腎皮質區腎小球及腎小管形態以及骨小梁形態基本正常；造模組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜基質擴張，足細胞足突大量融合，甚至脫落丟失。造模組大鼠骨小梁明顯稀疏，小梁之間的間隙變大，小梁變細，數量減少，連續性中斷，常見游離斷增多，符合臨床糖尿病腎病并發骨質疏松的病理特點。

本研究的意義在于：選擇了模型大鼠的基礎指標，包括血糖、體重、飲水量、尿量、尿蛋白、血脂、腎功能、骨密度及生物力學等，提供與臨床糖尿病腎病并發骨質疏松的特點相符合的表現和數據性資料。表明STZ 誘導的糖尿病腎病并發骨質疏松模型具有成模快的特點，6周時已有大量蛋白尿的腎損傷表現，與人類糖尿病腎病高度相似，在第8周時骨密度明顯下降，病情嚴重程度與病程相一致的特點。本研究成功建立了糖尿病腎病并發骨質疏松動物模型，為深入研究糖尿病腎病并發骨質疏松提供了基礎。