葛根素通過OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路介導對來曲唑引起骨流失的保護作用

韓俊 蔣現永 葉恒 陳東

武漢科技大學附屬漢陽醫院骨科，湖北 武漢 430050

芳香化酶抑制劑治療是激素受體陽性(HR+)乳腺癌絕經后婦女的公認治療方案[1]。來曲唑是一種非甾體芳香化酶抑制劑，是被批準用于患有HR+乳腺癌的絕經后婦女的三種藥物之一。芳香化酶抑制劑可以阻斷外周組織中雌激素的產生，從而將絕經后婦女體內循環中的雌激素水平降低到無法檢測到的水平[2]。雖然雌激素抑制是治療激素反應型早期乳腺癌的核心，但雌激素對維持骨密度(bone mineral density，BMD)也是必不可少的。雌激素水平降低，無論是由自然絕經還是醫源性絕經引起的，都會導致骨轉換增加和骨密度下降[3]。在芳香化酶抑制劑治療期間，進一步抑制絕經后雌激素水平會加速骨轉換、骨丟失和增加骨折發生率[4]。因此，早期使用抗骨質疏松癥藥物治療預防骨量降低顯得非常重要。葛根素是葛根葉提取物，是一種具有優良護骨作用的植物雌激素，其治療骨質疏松癥的療效已被廣泛報道。研究[5]發現喂飼含葛根素的飼料4周后，可抑制去卵巢小鼠股骨骨密度的下降。此外，葛根素還能預防去勢雄性大鼠骨丟失[6]。葛根素對破骨細胞的抑制作用在其治療骨丟失中占有重要地位。鑒于來曲唑常用于治療絕經后女性，本研究目的是為了觀察葛根素是否可以防治來曲唑對老年雌性大鼠骨骼的有害作用。

1 材料和方法

1.1 研究方案

30只老年(24月齡)雌性Sprague Dawley大鼠，體重為550～600 g。所有大鼠飼養在標準籠中，每籠4只，12∶12 h光暗循環，在(23±2)℃的舒適溫度下飼養，并喂食正常的標準嚙齒動物飼料，自由飲用自來水。30只老年雌性大鼠隨機分為3組(n=10/組)，對照組(CON組)、來曲唑治療組(LQC組)和葛根素聯合來曲唑治療組(GGS+LQC組)，每組10只。LQC組大鼠每周給予0.1 mg/kg來曲唑(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)灌胃治療；GGS+LQC組大鼠給予葛根素[50 mg/(kg·d)；Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA]灌胃，并每周給予0.1 mg/kg曲唑灌胃治療12周。

1.2 檢測指標

采集血樣兩次。首先，在第0周從尾靜脈取血，并在第12周后再次取血。在研究結束時對所有大鼠實施安樂死，并通過心臟穿刺收集4 mL血液。將血液以3 500 r/min離心12 min，收集血漿并儲存在-70 ℃直至進一步分析。使用ELISA試劑盒測定血清I型膠原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)和I型前膠原N端前肽(P1NP)；CV靈敏度分別<8%和<10%。上述試劑盒均使用德國羅氏公司提供。

采用含有Inveon MM系統的Micro-CT掃描股骨干骺端。在體素為8.82 μm、電壓80 kV、電流500μA、曝光時間1 500 ms的360個旋轉步長中采集圖像。用Inveon Research Workplace(西門子，慕尼黑，德國)計算參數如下：骨體積/總體積(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨密度。下頜骨感興趣區在3個方向均位于生長線以下的股骨干骺端小梁內。每組隨機選取5只大鼠，由3名獨立評估員進行股骨干骺端骨形態計量學參數測量，一式三份。

治療12周后，對大鼠進行安樂死，解剖出右股骨。使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)將股骨樣品脫鈣8周，將脫鈣的骨樣品包埋在石蠟中并使用Maason染色后用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)檢查組織切片。

隨后對股骨進行蛋白印跡(western blot，WB)分析。用RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，用BCA法測定其濃度。用10%SDS-PAGE分離出20 g蛋白，轉移到PVDF膜上。膜隨后在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，并在4 ℃下與OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin抗體(1∶2500；CAT)一起孵育過夜。最后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯的抗兔IgG抗體(1∶5000；CAT)孵育。編號7074；Cell Signal Technology，Inc.。37 ℃保溫1 h。Image J2X軟件版本2.1.4.7(Rawak Software，Inc.)用來測定蛋白質條帶密度。每個實驗一式三份，重復3次。

1.3 統計學分析

使用SPSS版本19.0進行統計分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比較不同組間的數據。P<0.05被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 骨代謝指標比較

三組血清P1NP和CTX如表1所示，和CON組比較，LQC組的P1NP和CTX顯著升高(P均<0.05)；而GGS+LQC組P1NP和CTX較LQC組明顯降低(P均<0.05)；各組間血清P1NP和CTX差異有顯著統計學意義(表1)。

表1 各組大鼠在實驗結束時測量的骨標志物比較

2.2 Micro-CT檢測結果

Micro-CT更好地顯示了骨小梁的總體改變情況，股骨的微觀參數如圖1所示。LQC組左側股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較CON組明顯降低，而Tb.Sp較CON組明顯升高(P<0.05)；而GGS+LQC組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較LQC組明顯升高，而Tb.Sp較LQC組明顯降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果Fig.1 Results of micro-CT at the femoral metaphysis of three groups of rats注：a：CON組，b：LQC組，c：GGS+LQC組。與CON組相比，*P<0.05；與LQC組相比，#P<0.05。

2.3 老年大鼠組織學變化的影響

本研究表明，葛根素改善來曲唑對老年雌性大鼠的骨組織傷害作用。如圖2所示，與LQC組相比，GGS+LQC組的大鼠骨小梁數量和密度得到明顯的改善。

圖2 各組大鼠股骨干骺端Masson切片檢測結果 A：CON組，B：LQC組，C：GGS+LQC組(×40)。Fig.2 Results of Masson slices at the femoral metaphysis of three groups of rats. A: CON group, B: LQC group, C: GGS+LQCgroup (×40).

2.4 OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路改變

和CON組比較，LQC組的大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路的顯著抑制，OPG、Wnt3α、β-catenin水平顯著降低，RANKL水平明顯升高，差異比較有統計學意義(P<0.05)。和LQC組比較，GGS+LQC組OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路明顯激活，OPG、Wnt3α、β-catenin水平顯著升高，RANKL水平明顯降低，差異比較有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 使用WB檢測OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin的相對表達Fig.3 Relative expression of OPG, RANKL, Wnt3α, and β-catenin to β-actin using Western blotting注：與CON組相比，*P<0.05；與LQC組相比，#P<0.05。

3 討論

雌性SD大鼠在出生后6～8周內達到成熟。研究表明，雌性大鼠在出生后的前3個月達到最大骨量。但隨著年齡的增長，骨小梁質量逐漸減少。骨形成和骨吸收參數在第3～7個月迅速下降[7]。為了更好地反映老年女性骨代謝狀態和骨骼特征，選取年齡對骨密度和骨轉換指標的影響，本實驗選用24月齡老年雌性大鼠，相當于70歲老年女性。本研究使用葛根素治療觀察其對來曲唑加重骨量流失和骨密度降低的影響。首先，老年雌性大鼠進行為期12周的治療后，來曲唑能顯著降低骨密度和股骨干骺端端骨小梁微觀結構。其次，葛根素干預12周后，發現葛根素能顯著改善來曲唑對老年雌性大鼠股骨遠端骨小梁BMD和微觀結構影響。第三，在葛根素治療過程中，發現老年雌性大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路和骨代謝均發生明顯改變。

本研究發現LQC組雌性大鼠BMD較CON組明顯降低。另外，在葛根素聯合來曲唑可以明顯改善來曲唑對骨密度降低的影響，導致GGS+LQC組BMD明顯升高。除了骨密度，骨保護的另一個重要評估指標是骨骼的形態參數，例如骨量和骨小梁厚度等[8]。本研究發現老年雌性大鼠股骨干骺端的骨小梁骨破裂，骨小梁變薄，骨小梁之間的間距變大。而來曲唑治療后老年大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著降低，而Tb.Sp顯著降低；葛根素干預治療后可以顯著增加骨小梁的數量以及之間連接，且明顯優于LQC組。這表明葛根素可以顯著保護來曲唑對老年雌性大鼠骨密度和骨量損害作用。

為了進一步評價治療效果，在研究結束時對骨轉換指標進行評估，分別測定血清P1NP和CTX水平作為骨形成和骨吸收的指標，CTX在LQC組明顯高于其他組。而葛根素治療后能使骨吸收指標(CTX)顯著降低；結果證實激素缺乏可導致大鼠的骨量減少和骨吸收增加[9]。研究結束時，LQC組大鼠血清P1NP平均水平高于其他各組，這可能是由于老年雌性大鼠體內雌激素缺乏導致骨轉換增加，而LQC干預后進一步影響所致[10-11]，導致血清P1NP升高。而葛根素治療顯著改善LQC對老年雌性大鼠骨代謝的影響，最終導致骨轉換下降，出現P1NP和CTX水平明顯降低。

Wnt/β-catenin活性的改變通常與發展性疾病和疾病(例如癌癥、神經元疾病和骨骼疾病)有關[12]。越來越多的證據表明，Wnt/β-catenin信號傳導途徑參與了成骨和骨形成的調控[13]。OPG是TNF受體超家族的成員，在抑制破骨細胞分化，破骨細胞吸收功能和促進破骨細胞凋亡中起關鍵作用[14]。此外，先前的研究得出結論，葛根素的抗骨質疏松作用是由于通過上調OPG/RANKL的比例來抑制破骨細胞的產生[15]。由于OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路在骨量流失過程中起著重要的作用，本研究觀察各組老年雌性大鼠治療后OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin表達情況，結果表明來曲唑治療組的OPG、Wnt3α和β-catenin表達明顯降低，這表明來曲唑對骨組織有害作用可能通過抑制OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路激活來實現的；而在來曲唑治療的基礎上給予葛根素干預后骨密度和骨量得到明顯改善，而OPG、Wnt3α和β-catenin表達明顯升高，這表明葛根素可以通過激活OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信號通路來促進骨形成，P1NP和CTX水平降低更好證實這一點。

總的來說，老年雌性大鼠在使用芳香化酶抑制劑出現明顯的骨量和骨密度降低，使用葛根素治療后可一定程度逆轉來曲唑對骨骼有害作用。但是本研究選擇研究對象特異性和數量有限，是否適合其他原因誘導的骨量流失還得進一步研究來驗證。