防己諾林堿對去卵巢小鼠骨代謝及骨微結構的影響

周琳 楊明理 王博浯 趙毅 曾春平

1. 廣州醫科大學附屬第五醫院內分泌科，廣州醫科大學第五臨床學院，廣東 廣州 510700 2. 遵義醫科大學醫學遺傳學教研室，貴州 遵義 563000

骨質疏松是一種嚴重威脅人類健康的疾病，主要表現為骨密度減少，骨脆性增加，骨折發生率增高。骨質疏松伴髖骨骨折患者5年內的死亡率比預期高出20個百分點[1]。骨質疏松以絕經后骨質疏松最為常見，這是因為絕經后雌激素不足會導致骨重塑不平衡，骨吸收作用大于骨形成，從而導致骨折風險增加[2]。防己諾林堿(Fangchinoline)是從防己科植物粉防己和盾狀輪環藤等植物的根部分離、純化的主要有效成分，為五環三萜皂苷，水溶性及穩定性良好。研究表明，防己諾林堿具有多種藥理作用，包括抗炎[3]、抗氧化應激[4]和神經保護作用[5]。且其同源類似物漢防己甲素具有抑制破骨細胞活性和骨保護作用[6]。據此，推測防己諾林堿對骨質疏松有保護作用。本實驗用去卵巢小鼠骨質疏松模型探討防己諾林堿對絕經后骨質疏松的保護作用，為骨質疏松的臨床用藥提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗藥物：防己諾林堿 (純度≥98%)購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.2動物：C57BL/6雌性小鼠40只，7周齡，體質量約20 g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究所，生產許可證號：SCXK(渝)2017-0003。所有小鼠在動物房適應性飼養1周后開始實驗。

1.1.3試劑：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)、I型膠原羧基末端肽(CTX)及I型膠原氨基末端肽(NTX)ELISA試劑盒購自北京北方生物技術研究所。雌二醇購自北京索萊寶公司。TRIZOL購買于美國invitrogen公司，Real-time PCR反應試劑SYBR?Premix Ex Taq購于大連TaKaRa公司。

1.1.4儀器：Skyscan 1174微型計算機斷層掃描儀(Micro-CT，比利時Bruker公司)；Gen5型多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組：將40只8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機分為4組，分別為空白(假手術)對照組、模型(去卵巢)組、陽性(雌二醇，E2)對照組、防己諾林堿組，每組各10只。

1.2.2造模及給藥：用10%水合氯醛將小鼠麻醉后，在兩側腹背部做0.5 cm切口，依次剝開皮膚、腹肌、腹膜、脂肪團，切除雙側卵巢。空白(假手術)對照組僅切除卵巢附近的同體積脂肪組織，余操作同卵巢切除小鼠。手術恢復1周后開始給藥，防己諾林堿組隔日經腹腔注射1 mg/kg防己諾林堿。陽性(雌二醇)對照組隔日經腹腔注射50 ng/kg雌二醇。空白對照組和模型組注射相同劑量的生理鹽水。

1.2.3體重測定：在小鼠行卵巢切除術(小鼠8周齡)時稱重一次，給藥中(小鼠12周齡時)稱重一次，處死小鼠(小鼠16周齡)時稱重一次。記錄小鼠體重變化。

1.2.4小鼠血清鈣、磷、TRAcP、CTX、NTX的測定：手術8周后，將所有小鼠采用眼球摘除法取血，2 000 r/min離心10 min，取上層血清，放置于-80 ℃備用。用ELISA試劑盒檢測血清鈣、磷水平及TRAcP、CTX、NTX含量。

1.2.5骨微結構指標測定：手術8周后，處死小鼠，取一側股骨。用micro-CT檢測并分析小鼠股骨的骨小梁百分比(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.6小鼠骨組織骨質疏松相關基因檢測：手術8周后，取小鼠另一側股骨，將小鼠股骨干骺端在液氮中研磨成粉，按照TRIZOL說明書進行操作，從股骨干骺端提取RNA。用1μg 總RNA通過oligo-dT 引物逆轉錄成cDNA，檢測破骨細胞標志基因的擴增情況。引物設計如下：TRAcP (forward：5’-TGT GGCCATCTTTATGCT-3’；reverse：5’-GTCATTT CTTTGGGGCTT-3’)；Cathepsin K (forward：5’-GGG AGAAAAACCTGAAG-3’；reverse：5’-ATTCTGG GGACTCAGAGAGC-3’)；NFATc1 (forward：5’-CAA CGCCCTGACCACCGATAG-3’；reverse：5’- GGC TGCCTTCCGTCTCATAGT-3’)；CTR (forward：5’-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3’；reverse：5’-CTCGT GGGTTTGCCTCATC-3’)；GAPDH (forward: 5’-ACC ACAGTCCATGCCATCAC-3’；reverse：5’-TCCA CCACCCTGTTGCTGTA-3’)。PCR反應結束后，以GAPDH 基因為內參，計算各基因的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 防己諾林堿對OVX小鼠體重的影響

在小鼠行卵巢切除術即小鼠8周齡時，各組小鼠體重無明顯區別。在給藥中即小鼠12周齡時，模型組較空白對照組體重上升，差異有統計學意義，其余各組體重差異無明顯區別。處死小鼠即小鼠16周齡時，模型組及防己諾林堿組較空白對照組體重明顯上升，E2組體重較模型組顯著下降，防己諾林堿與模型組體重無明顯差異，E2組與空白對照組體重無明顯差異(表1)。

表1 防己諾林堿對小鼠體重的影響Table 1 Effect of fangchinoline on mice weight g)

2.2 防己諾林堿對OVX小鼠骨質疏松相關血清學指標的作用

ELISA檢測結果顯示，各組之間血清鈣、磷水平無顯著差異。與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組TRAcP、CTX和NTX水平顯著降低。與空白對照組相比，防己諾林堿組及E2組的TRAcP、CTX和NTX含量差異無統計學意義(表2)。

表2 防己諾林堿對小鼠骨質疏松血清學指標的作用Table 2 Effects of fangchinoline on osteoporosis related biomarkers in mice

2.3 防己諾林堿對OVX小鼠骨量流失的作用

Micro-CT結果顯示，與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高，Tb.Sp明顯降低。與空白對照組相比，防己諾林堿組及E2組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th及Tb.Sp差異無統計學意義(圖1，表3)。

表3 防己諾林堿對去卵巢小鼠股骨骨微結構的作用Table 3 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized

圖1 防己諾林堿對去卵巢小鼠股骨近端骨微結構的影響Fig.1 Effects of fangchinoline on femoral microarchitecture in ovariectomized mice

2.4 防己諾林堿對OVX小鼠骨組織骨質疏松相關基因的作用

實時熒光定量PCR檢測結果表明，與模型組相比較，防己諾林堿組及E2組破骨細胞標志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)顯著降低。與空白對照組相比，防己諾林堿組及E2組的破骨細胞標志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)差異無統計學意義 (表4)。

表4 防己諾林堿對小鼠骨組織骨質疏松相關基因的作用Table 4 Effects of fangchinoline on osteoporosis related genes expression in

3 討論

骨質疏松癥已經成為嚴重威脅人類健康的疾病。骨重建包括骨形成和骨吸收兩個相互平衡的過程，分別由成骨細胞和破骨細胞調控，當破骨細胞的骨吸收功能超過成骨細胞的骨形成，即引起骨質疏松[7]。目前常用的骨質疏松藥物有雙膦酸鹽和雌激素，然而這些抗骨質疏松藥物各有缺點，例如雙膦酸鹽與下頜骨壞死及非典型股骨轉子下骨折風險相關；雌激素則會提高乳腺癌及子宮癌的發病風險[8]。因此，尋找有效安全的抗骨質疏松藥物具有重要意義。中醫藥具有較高的安全性和有效性[9]，通過多個機制發揮對骨質疏松的防治作用，例如具有類雌激素、抗氧化、抗炎癥反應等作用，以及通過調節多條信號通路抑制破骨細胞分化和促進成骨細胞分化[10]。因此，中醫藥有望成為防治骨質疏松的主要手段之一。

防己諾林堿是從防己科植物粉防己和盾狀輪環藤等植物的根部分離、純化的主要有效成分，為五環三萜皂苷，水溶性及穩定性良好。研究表明，防己諾林堿具有抗炎、抗氧化應激等多種藥理作用[3-5]，提示防己諾林堿可能具有骨保護作用。雌激素能抑制破骨細胞功能，同時促進成骨細胞功能。絕經導致的雌激素低下是誘發骨質疏松癥的重要原因。去卵巢小鼠模型是模仿絕經后婦女生理特征而設計的一種成熟的動物模型，成功模擬了因雌激素缺乏而導致的骨質疏松[11]。因此，本研究采用去卵巢小鼠模型研究防己諾林堿對骨質疏松的保護作用。根據預實驗結果，本次實驗選取1 mg/kg濃度的防己諾林堿進行動物實驗。實驗結果表明，相較于空白對照組，去卵巢模型小鼠體重明顯升高，這是因為較低水平的雌二醇能導致體重增加；E2組體重較模型小鼠明顯下降，與空白組無明顯區別，這是雌激素替代的生理結果。防己諾林堿組體重也較空白對照組明顯升高，與模型組小鼠無明顯區別，說明防己諾林堿對去卵巢導致的體重增加無明顯作用。經防己諾林堿處理后，去卵巢小鼠骨吸收相關血清學指標TRAcP、CTX、NTX水平明顯下降；BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高，Tb.Sp明顯降低，E2組也有相似的結果。以上結果表明，防己諾林堿有提升骨量、改善骨質疏松的作用，各組間血鈣和血磷含量無明顯區別。這可能是因為雌激素可以抑制甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)[12]，降低血鈣，同時雌激素還可抑制骨鈣素，升高血鈣，因此雌激素對鈣磷代謝無明顯作用。同時去卵巢手術和防己諾林堿對鈣磷代謝也無明顯作用，因此各組血鈣和血磷無明顯區別。經防己諾林堿處理后，去卵巢小鼠破骨細胞標志基因(TRAcP、Cathepsin K、NFATc1和CTR)表達水平明顯下降，提示防己諾林堿的骨保護作用可能與抑制破骨細胞的分化及骨吸收功能有關，其作用的具體分子機制值得進一步深入研究。

綜上所述，本研究表明防己諾林堿對去卵巢引起的骨量流失具有保護作用，為其應用于骨質疏松癥的治療提供了實驗依據。