長白山地區龍膽生產品質影響因素探究

武靖涵，左 柏，張天柱*

（1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.吉林省北藥藥材加工有限公司，長春 130000）

龍膽為龍膽科植物龍膽Gentiana scabra Bge.、條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、三花龍膽Gentiana triflora Pall.或堅龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖[1]。首載于《神農本草經》，其味苦，性寒，歸肝、膽經，有清熱燥濕、瀉肝膽火的作用[2]。除堅龍膽外，主產于內蒙古、河北及東北三省地區。

近年來，由于中藥用量大幅度增加，促使飲片生產逐漸由小規模作坊式轉向現代化、工業化、標準化和規范化，且隨著《中華人民共和國中醫藥法》的實施和中藥標準化項目的設立，飲片標準化生產的重要性也逐漸顯現[3-6]。龍膽作為常用大宗藥材，飲片生產過程較為簡單，主要有“選、洗、潤、切、干”五道工序。在前期已得出龍膽在實際工業中最佳生產方法的基礎上，本研究選擇不同產地、不同等級的龍膽藥材，以龍膽苦苷和水溶性浸出物的含量為指標，探究飲片生產過程中對其質量產生影響的因素，為龍膽從藥材到飲片的生產過程中的質量傳遞提供依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 龍膽苦苷對照品（批號：110770-201013）購于中國藥品生物制品檢定所，甲醇為分析純（北京化工廠）、色譜純（Fisher Chemical）；水為超純水。龍膽藥材由吉林北藥藥材加工公司提供，基源由各產地工作人員鑒定龍膽藥材來源，見表1。

1.2 儀器 PM1 000 高效液相色譜儀（日立儀器有限公司），BT25S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司），PTX-FA110S 萬分之一電子天平（福州華志科學儀器有限公司），YM-100S 超聲波清洗機（深圳市語盟超聲波清洗劑設備廠），Medium-s300 實驗室純水系統（上海和泰儀器有限公司）。

炮制機械設備來自吉林省北藥藥材加工有限公司藥品生產質量管理規范（GMP）車間，主要有篩選機（型號：SX-2，富陽亳州康華制藥機械有限公司）、振動篩（型號：XZS-2，天津市渤海鑫茂制藥設備有限公司）、變頻風選機（型號：FX-1，天津市渤海鑫茂制藥設備有限公司）、熱風循環烘箱（型號：CT-C-I，南京飛翔干燥制冷設備廠）、直線往復式切藥機（型號：WFQY-300，天津市渤海鑫茂制藥設備有限公司）。

表1 龍膽藥材來源

2 方法與結果

2.1 龍膽苦苷含量測定方法

2.1.1 色譜條件 PM-1 000 日立高效液相色譜儀；色譜柱Agilent XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相為甲醇（A）:水（B），洗脫程序為：0～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A；流速為0.8 mL/min；柱溫為35℃；檢測波長為243 nm；進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取一定量龍膽苦苷對照品置于20 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為1.201 mg/mL 的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取批次1 龍膽適量，粉碎，過四號篩，取約0.5 g，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加50%甲醇約18 mL，超聲（功率250 W，頻率20 kHz）30 min，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關系 取“2.1.2”對照品溶液，分別進樣4、8、12、16、20、24 μL，測定峰面積。以進樣體積、峰面積為橫、縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為Y=1,413,755,967.65X-57,438.07，r=1.00，在4.802～28.812 μg 范圍內，龍膽苦苷線性良好。

2.1.5 重復性 在批次1 中平行取6 份樣品，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.1”條件依次進樣，記錄色譜峰面積，計算龍膽苦苷含量。測定結果為：龍膽苦苷含量平均為4.788%，RSD 為：0.09%，方法重復性良好。

2.1.6 穩定性 取批次1 樣品適量制備供試品溶液，室溫下放置，在0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1.1”方法分別測定，記錄峰面積。龍膽苦苷色譜峰面積RSD 為0.51%，供試品溶液24 h 內穩定性良好。

2.1.7 精密度 取批次1 同一供試品溶液，按“2.1.1”條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。龍膽苦苷色譜峰面積RSD 為0.23%，儀器精密度良好。

2.1.8 加樣回收率 取批次1 龍膽粉末樣品（已知成分含量）6 份，約0.5 g，精密稱定，加入龍膽苦苷對照品適量，按“2.1.3”方法制備加樣供試品溶液，按“2.1.1”條件測定，記錄峰面積，計算含量及回收率。結果龍膽苦苷回收率為99.93%，RSD 為1.09%。回收率在95.0%～105.0%之間，RSD 均小于3.0%，該方法回收率較好。

2.1.9 樣品測定 稱取龍膽樣品，按“2.1.3”項下操作制備龍膽供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別進樣10 μL，測定峰面積，見圖1 和圖2。各樣品龍膽苦苷及水溶性浸出物含量，見表2。各批次龍膽中龍膽苦苷含量均符合《中國藥典》2015 版標準。

2.2 龍膽藥材指紋圖譜的建立 取12 批龍膽藥材粉末，按“2.1.2” “2.1.3”方法制備對照品溶液和供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件依次測定，得到色譜圖（圖1、圖2）。將12 批次龍膽樣品的色譜圖導入2004 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件，進行多點校正及自動匹配，以S1 為參照圖譜，選用中位數法，時間窗寬度0.1 min，得到對照圖譜R，12 批次龍膽藥材指紋圖譜，見圖3。經過匹配，確認13 個共有色譜峰，再與對照品色譜圖相比較，確認13 個共有特征峰中，5 號峰為龍膽苦苷。以5 號峰龍膽苦苷為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間及其RSD，并應用軟件計算相似度。計算結果為，各共有峰保留時間的RSD分別為0.33%、0.39%、0.20%、0.38%、0.00%、0.25%、0.31%、0.14%、0.15%、0.19%、0.19%、0.16%、0.14%，相似度均大于0.9。指紋圖譜結果表明各批次龍膽樣品質量較穩定，無明顯差異。

圖1 混合對照品 HPLC 圖譜

圖2 龍膽樣品S1 HPLC 圖譜

圖3 12 批龍膽藥材指紋圖譜

2.3 水溶性浸出物測定 按照水溶性浸出物測定法（《中國藥典》2015 版第四部通則2201）項下的熱浸法測定，結果見表2。

2.4 生產過程樣品測定 龍膽飲片生產過程可分為如下工序：揀選、水洗、潤制、切制和干燥。依據前期實驗室正交試驗及實際生產驗證，龍膽實際生產過程為龍膽藥材經篩選及人工揀選后，快速“搶水洗”，悶潤2 h，切段，自然晾干。對品質產生影響的因素主要為水洗、潤制和干燥三個環節。為在同一條件下比較樣品質量，規定“搶水洗”時長統一為60 s。樣品制備過程，見圖4，各批次樣品測定結果，見表2。

各批次樣品中龍膽苦苷與水溶性浸出物含量變化趨勢見圖5 和圖6[7]。由折線圖及文獻得出，龍膽苦苷含量經“搶水洗”后，非藥用部位、雜質被除去，龍膽苦苷實際含量未變但相對含量升高；經潤制后龍膽苦苷含量增減不定，是由于潤制過程中龍膽苦苷溶于水后水留存或流失導致；經干燥后龍膽苦苷含量明顯增加[8-11]。龍膽經水洗后水溶性浸出物明顯減少，表明水洗工序帶走部分浸出物，所以在完成洗凈的前提下應盡量縮短水洗時間；潤藥后，浸出物少量增加，推測由于龍膽內水溶性裂環烯醚萜苷類成分繼續溶出；干燥后浸出物明顯增加。

圖4 樣品制備過程

表2 各樣品龍膽苦苷及水溶性浸出物含量 %

圖5 1～6 批次樣品含量變化

圖6 7～12 批次樣品含量變化

3 結語

本實驗在藥典基礎上，對檢測波長、洗脫程序及龍膽樣品的提取方法和溶劑進行優化。實驗過程中發現，其他條件相同情況下，檢測波長243 nm 得到的譜圖相對于270 nm 得到的譜圖色譜峰數量更多，峰形更好，可增加指紋圖譜中的共有峰數量，使評價更全面。流動相在《中國藥典》甲醇—水（25:75）的基礎上，根據出峰時間、分離度、峰形等進行調節，最終確定洗脫程序為0～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A，使各峰之間分離分析效果較好，利于計算。提取方法方面分別考察加熱回流15 min、超聲提取（功率250 W，頻率20 kHz）30、45、60 min，比較3 個成分的含量，結果較為相近，由于超聲提取法簡單易行，故選擇超聲提取30 min。提取溶劑考察100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇，其余條件相同情況下，結果顯示50%甲醇提取效果較好且節約成本，故選擇提取溶劑為50%甲醇[12-14]。

龍膽生產過程中，已廣泛使用炮制機械[15]。揀選一步，單獨使用篩選機或風選機等炮制機械，揀選效果不佳，殘留雜質較多，雖然采用人工效果較好，但是會導致時間和人工成本大幅度增加，所以實際生產中一般采用先篩選或風選，出去部分雜質，再進行人工揀選，除去根部細小雜質或多余須根、殘莖。水洗一步，一般無明確時間要求，但由于龍膽苦苷等成分溶于水，所以水洗時間應盡量減少，最短時間內洗凈泥沙及多余雜質，稱“撈洗”或“搶水洗”。潤藥一步，由于龍膽整體體積較小，水洗后表面留存水量較少，潤藥過程中易蒸發，實際生產中一般采用悶潤，即在潤藥容器表面加蓋一層隔水隔熱材料，減少水分散失，使悶潤更充分[16]。切制一步，雖然有設定長度，但是由于原料藥材在傳動帶上的擺放位置、前進速度及往復式切藥機刀口升降頻率、機器精度等問題，并不能做到切制后的飲片長度精確一致，一般在±3 mm 范圍內浮動，依據《中國藥典》2015 版第四部炮制通則中關于切制短段長度為5～10 mm 的規定，可設定儀器切制長度為7 mm[17-18]。切制工序經過查找文獻、進行預實驗和咨詢飲片生產車間技術人員后，視為對龍膽質量不產生影響[7]。干燥一步，《中國藥典》2015版規定龍膽飲片水分不得超過9.0%，應隨時關注、控制樣品中水分，不超過藥典標準且不過度干燥[19-20]。

綜上所述，在龍膽飲片生產過程中，以龍膽苦苷和水溶性浸出物為主要指標，龍膽品質受干燥因素影響較大，具體原因尚不明確，有待進一步探究。本研究在已完成龍膽飲片炮制生產優化的基礎上完成，對實際生產中把握生產進程、控制產品質量有一定實際應用意義，也可為其他炮制方法相似的藥材提供實際生產方面的參考。