中藥活性成分阿魏酸抗血小板活性和抗血栓作用的研究*

★ 劉海云 林倩霞 紀玉龍 支雪萍 李會麗 陳愛社 侯本超（.江西中醫藥大學 南昌 330004；2.南昌大學第一附屬醫院 南昌 330029）

血栓性疾病的病因及發病機制十分復雜，當血管內皮損傷，繼而血小板數量增加，人體凝血活性顯著增強而抗凝活性降低，導致血栓形成，其臨床病理過程還包括血栓栓塞。近年來血栓性疾病位居廣大疾病病因之首，具有高致死率和高致殘率，包括有缺血性中風、冠心病、急性冠狀動脈粥樣綜合征、肺栓塞、外周血管疾病等，嚴重威脅人類的生命健康［1］。在血栓以及動脈粥樣硬化的形成過程中，血小板起著重要的作用，其中血小板活化異常是血栓形成的重要病理學基礎［2］。抗血小板藥物可抑制血小板活化，對上述疾病有一定療效。因此具有抗血小板活性的藥物對于防治血栓有著重要作用。

阿魏酸是桂皮酸衍生物，易溶于熱水，難溶于苯，傘形科植物，化學名稱為4-羥基3-甲氧基肉桂酸。阿魏酸熔點為174 ℃，性質穩定，順式為黃色油狀物，反式為纖維狀結晶，合成方法簡單快速［3］。阿魏酸也是一種功能性酚酸，具有強大的抗氧化活性，存在于植物細胞壁中，也可使人體產生自由基的酶受到抑制同時清除自由基的酶增加，起到未病先防的作用。因此阿魏酸多領域有著多種用途。它在醫療醫藥、美容醫學、化妝品護膚品原料等有著獨特的作用，主要由于其對皮膚結構具有保護作用，主要作用于角質形成細胞，成纖維細胞，纖維母細胞，膠原蛋白，彈性蛋白。它抑制黑色素生成，增強表皮抵抗力，增強血管生成，增強新陳代謝并加速傷口愈合。作為光保護劑，延緩皮膚光敏感過程和皮膚老化而廣泛用于護理類制劑中。它不僅存在于粗糧、堅果、干果、綠葉蔬菜等食物中，更廣泛存在于多種中藥中如：活血化瘀的當歸、川芎，清熱的木賊、升麻、梓白皮，寧心安神的酸棗仁等［4-5］。

藥理研究和臨床應用表明，阿魏酸鈉具有保護心血管和拮抗內皮素生成等功效，以及還具有抑制炎性介質生成、抗血栓形成等作用，具有廣闊的挖掘潛力。阿魏酸毒性低，具有多種生理功能（抗炎，抗腫瘤，抗氧化，抗老化，抗微生物活性和抗糖尿病作用）。血液流速減慢，粘稠度升高，血小板聚集和血栓形成是導致出血性和缺血壞死性疾病的病理學基礎。心腦血管疾病與血小板活性、凝血因子活性、血液粘稠度和血栓形成密切相關，為此本文研究阿魏酸抗血小板聚集、抗凝血及抗血栓形成作用，并闡明其作用機理。阿魏酸有順式和反式兩種結構，雖然一些文獻表明阿魏酸抗血栓有一定作用但并未說明是哪種結構發揮作用。本文從研究阿魏酸反式結構著手進一步研究其是否具有抗血小板活性及抗血栓的作用，從而來明確抗血栓的結構類型，為其在心血管類疾病治療方面的應用提供實驗和理論依據。

1 材料

1.1 動物 購入昆明種小鼠（雌雄各半）40 只，體重在18～22 g 范圍內；SD 大鼠，雄性，體質量300～350 g；由江西中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（贛）2015-0026。將小鼠置于室溫20 ℃～22 ℃，空氣濕潤新鮮，采光和通風良好的環境中培養。均以固體飼料喂養，雌雄分籠放置，可自由活動飲水。預培養1 周左右，每日觀察大小鼠的精神狀態，正式開始實驗。

1.2 試劑 阿魏酸（浙江銀和藥業有限公司）；凝血酶時間（TT）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）試劑盒均為上海太陽生物技術有限公司產品，批號分別是20120116，20120316，20121117，20120124；阿 司 匹 林 購自 于Sigma 公 司（50 Fmol/L）；Fura-2（購 自 于Sigma 公司），其他生化試劑均為國產分析純。烏拉坦（上海展云化工有限公司，批號：120314）；阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業有限公司，批號：20065051），二磷酸腺苷adeno-sine diphosphate，ADP，上海麗珠東風生物技術有限公司）

1.3 儀器 微量進樣器（德國eppendorf 公司），恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），AdventurerTM 電子天平（奧豪斯國際貿易有限公司），TGL-16G 型臺式高速離心機（上海市實驗儀器總廠），TECAN 酶標儀sunrise（奧地利TECAN 公司），SYSMEXCA-1500 血凝儀（SYSMEX公司）；TYXN-91 智能血液凝聚儀（上海通用機電技術研究部）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 SD 大鼠50 只，隨機分為5組，每組10 只。組一命名為空白對照組（給予等量生理鹽水）、組二命名為陽性對照組 （給予阿司匹林30 mg·kg-1）、組三命名為阿魏酸低劑量組（給予7.5 mg·kg-1）、組四命名為中劑量組（給予15 mg·kg-1）、組五命名為高劑量組（30 mg·kg-1）。各組動物均灌胃給藥，連續7 d；小鼠50 只，隨機分為5 組 ，每組10 只，按大鼠的分組方法和劑量給藥7 d。阿魏酸的劑量設置參照文獻［6］。

2.2 中藥阿魏酸對大鼠凝血功能的影響［7］末次給藥2 h 后腹腔注射20 %氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，按照無菌操作，腹主動脈采血，采用3.8%檸檬酸鈉抗凝，血液與抗凝劑之比為9∶1，然后以2500 r·min-1離心10 min，取血漿。按試劑盒說明測定TT、PT 和APTT。

2.3 對小鼠凝血時間的影響［8］本實驗采用毛細玻璃管法測定全血凝血時間。每組大鼠小鼠按照“2.2”中分組方法與劑量給藥7 d，記錄每次給藥時間。于末次給藥后2 h 用直徑1 mm 的玻璃毛細管插入小鼠眼底靜脈叢取血，血液迅速流入毛細玻璃管，當毛細管血液被注滿后使其平放于桌上，開始計時，每隔20 s 折斷兩兩端毛細玻璃管，并緩慢向左右拉開，直至出現血凝絲停止計時，所得時間即為小鼠凝血時間（CT）。

2.4 對大鼠動一靜脈血流旁路血栓形成的影響［9］按照“2.2”中的動物分組、方法與劑量規律給藥7 d。末次給藥2 h 后，腹腔注射20%氨基甲酸乙酯1 mL/Kg，麻醉大鼠，嚴格按照無菌操作，將大鼠固定于手術架，頸部剪毛，消毒，鋪巾，提捏頸部，在正中剪3 cm 切口，逐層分離，充分暴露出右頸總動脈和左頸外靜脈，動作輕柔避免牽拉，然后取一根由三段聚乙烯管組成的套管，水平放置，在管中段放一根6 cm 長度的精密質量的4 號手術絲線，注入肝素生理鹽水溶液（50 u·mL）充滿聚乙烯管，輕柔穩定插進分離出的右頸總動脈和左頸外靜脈，防止溶液溢出，動-靜脈血流旁路開放15 min 后中斷血流，迅速取出絲線稱質量，總質量減去絲線質量即得血栓濕重，60 ℃干燥30 min，稱量干重，并計算血栓抑制率。

抑制率=（空白組血栓質量-給藥組血栓質量）/空白組血栓質量×100 %

2.5 統計處理 用統計分析軟件SPSS 17.0 對各組實驗數據進行處理分析，實驗結果用表示，用LSD 法行組間兩兩分析并進行比較，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 阿魏酸對大鼠凝血功能的影響 與正常對照組比較，阿魏酸小劑量組對延長TT、PT、APTT 的作用不明顯，差異無統計學意義；阿魏酸中、大劑量組和阿司匹林顯著延長TT、PT、APTT，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表1。

表1 阿魏酸對大鼠凝血功能的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 PT/s TT/s APTT/s正常對照組（生理鹽水） - 14.12±0.51 18.43±0.15 29.12±0.25阿司匹林組 30 23.14±0.321） 30.12±0.331） 42.62±0.321）低劑量給藥組 7.5 15.19±0.32 19.24±0.14 31.43±0.672）中劑量給藥組 15 21.09±0.242） 25.21±0.281） 35.51±0.251）高劑量給藥組 30 28.32±0.121） 41.34±0.341） 24.11±0.621）注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

3.2 對小鼠凝血時間的影響 實驗結果證明，與對照組比較，實驗組中阿魏酸低劑量組CT 延長不明顯，而阿魏酸中、高劑量組和陽性對照組（阿司匹林）CT 明顯延長（P＜0.05、P＜0.01），其延長率分別為28.9 %、46.7 %，見表2。

3.3 對大鼠動一靜脈旁路血栓形成的影響 結果表明，與正常對照組比較，阿魏酸低、中、高劑量組和阿司匹林組均明顯減輕血栓濕重（P＜0.01，P＜0.05），有統計學意義。阿魏酸低、中、高劑量組對大鼠動一靜脈旁路血栓抑制率分別為14.28 %，20.69 %和32.65 %（P＜0.05），見表3。

表2 對小鼠凝血時間（CT）的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 CT/s 延長率/%正常對照組（生理鹽水） - 300.42±43.15 -阿司匹林組 30 510.04±68.621） 60.5低劑量給藥組 7.5 332.25±48.242） 8.4中劑量給藥組 15 350.09±51.431） 28.9高劑量給藥組 30 406.18±58.161） 46.7注：與正常對照組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

表3 對大鼠動一靜脈旁路血栓形成的影響（，n=10）組別 劑量/mg.kg-1 濕重/mg 干重/mg 抑制率/%正常對照組（生理鹽水） - 40.42±1.15 18.26±0.64 -阿司匹林組 30 21.32±1.261） 11.32±0.621） 37.23低劑量給藥組 7.5 36.69±2.122） 16.42±1.23 14.28中劑量給藥組 15 30.09±2.421） 14.21±1.382） 20.69高劑量給藥組 30 23.76±3.821） 12.78±1.221） 32.65注：與生理鹽水組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

4 討論

隨著生活水平的提高，心血管疾病的發病率也逐年增加，血栓性疾病占心血管疾病的比例很高。據數據統計，我國血栓性疾病患者超過1 千萬，發病率遠高于其他疾病，且有逐年遞增的趨勢［1］，其中血小板功能異常導致的血栓疾病是心血管疾病發病的主要原因［10］。抗血栓的西藥存在很大的副作用，所以選用副作用小又有效的中藥是切實可行的方法，對臨床防治抗血栓形成具有重要意義。

血栓的形成與血小板的聚集、黏附及釋放反應有關。血液凝固包括內源性凝血和外源性凝血兩種途徑。內源性凝血是由十二凝血因子啟動的，通過激活血小板的膜表面磷脂。外源性凝血是組織損傷由血管外的組織因子釋放入血而啟動的凝血過程。凝血時間和凝血酶原時間可以反映內外源性凝血的功能狀況［11］。

凝血功能指標PT、TT、APTT 在一定程度上能夠反映機體凝血系統的狀態，APTT 和TT 可以反映內源性凝血的功能狀態，PT 是反映外源性凝血途徑的指標。本實驗結果表明阿魏酸明顯延長了大鼠血漿中PT、TT、APTT，說明阿魏酸能抑制內、外源性凝血，從而抑制凝血酶的活性達到抗血栓的作用。

小鼠出血時間主要反映血小板的功能。出血時間的長短與血小板的數量和功能、毛細血管功能、凝血因子及纖溶等因素有關，毛細血管功能和血小板對其的影響最大。本實驗結果表明阿魏酸明顯延長小鼠的出血時間，其原因可能是通過抑制血小板活性實現的。

血管內皮破壞、血小板功能異常以及血流改變與淤積是血栓形成的三個因素［12］。而血小板粘附聚集是血栓形成過程中很重要的一步，通過阻斷血小板活化或抑制與其它配體結合可以影響血小板粘附聚集［13］。血小板的黏附性是血小板與粗糙物接觸，黏附于其表面，是一項重要的止血功能。血小板黏附率越高，聚集性越強，血液粘稠度增高，易形成血栓。動靜脈旁路血栓模型的建立是用于測量整體血流中血液速度、血液粘稠度及血小板的吸附能力和聚集的影響［14］。血小板功能的異常是血栓結構能夠形成的直接原因，該血栓模型類似動脈中的白色血栓，比較接近人體的生理與病理狀態［15］。動脈血流中的普遍廣泛存在的血小板一旦接觸粗糙物表面，血小板的粘附性立馬表現出來，隨著動脈血流動，血液粘稠度迅速升高，血液中累積的血小板聚集環繞在粗糙物表面而快速形成血小板血栓。形成的血栓濕重越小，對應的血栓形成抑制率就越大。本實驗結果表明中藥各組及陽性對照組均可減輕動靜脈旁路形成的血栓干濕重，證明中藥阿魏酸對血栓形成具有一定的抑制率。

綜上所述，中藥活性成分阿魏酸可以延長小鼠凝血時間，中高劑量組明顯延長大鼠PT、APTT、TT， 中藥各劑量組明顯減輕動靜脈旁路血栓干重和濕重，明顯增加了血栓抑制率，從而達到抗血栓的作用。由此表明，阿魏酸具有顯著抗血栓的功效，其抗血栓的作用可能與改善凝血功能、血小板聚集黏附功能有關。