胃癌細胞系中CD44+胃癌干細胞的表達和意義

任芳 陳毅德 馮麗華 鄭志高 范鑫 林雨標 馮水土

摘要：目的? 探討胃癌細胞系中CD44+胃癌干細胞的基因表達及其意義。方法? 采用無血清培養基獲得漂浮球，在胃腺癌細胞系MKN-45中用FACS檢測腫瘤干細胞（CSC）表面標志物CD44的表達，采用FACS分離CD44+亞群，通過體外培養鑒定兩種不同細胞群CD44+和CD44-中的致瘤、自我更新、分化特性，采用實時RT-PCR評估CD44+和CD44-中干細胞特異性基因的表達。結果? MKN-45和NCI-N87在無血清培養基中形成胃癌微球體，而KATOⅢ和AGS不能形成胃癌微球體，MKN-45細胞系經FACS分選CD44+和CD44-中細胞，80%MKN-45細胞高表達CD44;CD44+細胞在無血清培養基中顯示出更高的微球體形成、分化特性;參與Wnt2、Bmi1、Oct3/4、Notch1、Sox2、Nanog和其他基因的“干細胞”基因的表達水平在CD44+亞群中高于CD44-亞群。結論? 人胃癌細胞中的CD44+亞群可能含有胃癌干細胞樣細胞，可為胃癌的診斷、治療提供參考。

關鍵詞：胃癌;CD44;胃癌干細胞;基因表達

中圖分類號：R735.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.013

文章編號：1006-1959（2020）20-0045-06

Expression and Significance of CD44+ Gastric Cancer Stem Cells in Gastric Cancer Cell Lines

REN Fang，CHEN Yi-de，FENG Li-hua，ZHENG Zhi-gao，FAN Xin，LIN Yu-biao，FENG Shui-tu

（Department of Oncology and Hematology，Xiamen Haicang Hospital，Xiamen 361026，Fujian，China）

Abstract：Objective? To investigate the gene expression and significance of CD44+ gastric cancer stem cells in gastric cancer cell lines.Methods? Floating spheres were obtained with serum-free medium. FACS was used to detect the expression of tumor stem cell （CSC） surface marker CD44 in gastric adenocarcinoma cell line MKN-45， CD44+ subgroups were separated by FACS， and two different cell populations were identified by in vitro culture The tumorigenicity， self-renewal， and differentiation characteristics of CD44+ and CD44-. Real-time RT-PCR was used to evaluate the expression of stem cell-specific genes in CD44+ and CD44-.Results? MKN-45 and NCI-N87 formed gastric cancer microspheres in serum-free medium， while KATOⅢ and AGS could not form gastric cancer microspheres. The MKN-45 cell line was sorted by FACS for CD44+ and CD44- cells， 80% MKN-45 cells highly express CD44; CD44+ cells show higher microsphere formation and differentiation characteristics in serum-free medium; the expression level of "stem cell" genes involved in Wnt2， Bmi1， Oct3/4， Notch1， Sox2， Nanog and other genes CD44+ subgroup was higher than CD44- subgroup.Conclusion? The CD44+ subset of human gastric cancer cells might contain gastric cancer stem cell-like cells， which could provide references for the diagnosis and treatment of gastric cancer.

Key words：Gastric cancer;CD44;Gastric cancer stem cells;Gene expression

盡管胃癌（gastric cancer，GC）的發病率和死亡率一直下降，但它仍然是世界上第5大最常見的惡性腫瘤，2012年大約有100萬新增病例，尤其普遍在東亞（主要在中國）。同時，胃癌是全球癌癥死亡的第3大原因 [1]。大多數患者早期無癥狀或存在非特異性癥狀，確診時常為晚期，日本和韓國使用鋇光熒光檢查或內窺鏡檢查，更有利于早診斷、早治療[2]。GC被認為是一種預后不良的惡性疾病，5年生存率<30%[3]。目前GC研究的主要焦點是通過尋找新工具和技術來實現早發現、早診斷、早治療[4]。因此，如何識別且清除早期胃癌細胞是胃癌患者早診斷、早治療的關鍵。癌癥干細胞（CSC）可以為胃癌診斷和治療提供新方法。研究表明，CSCs是腫瘤起始、侵襲、遠處轉移和抗癌藥物耐藥的原因[5]，胃CSC可能在胃癌早期發揮重要作用并促進腫瘤發生進展。目前有學者推測可通過特定表面標志物的鑒定CSC [6]，其中CD44首先被確定是乳腺癌的特異性CSC標志物[7]，也已被證明是其他許多實體瘤的CSC標志物[8]，也有學者認為CD44可能也是胃CSC標志物[9]。本研究從人MKN-45胃腺癌細胞系中分離、鑒定、并培養胃CSC細胞，觀察CD44+細胞的特性，評估其作為胃癌細胞表面標志物的價值。

1材料與方法

1.1細胞培養? 人胃癌細胞系MKN-45、NCI-N87、KATOⅢ、AGS購自ATCC公司，置于含10%胎牛血清的1640培養基（HyClone）中培養;加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素（Gibco）;在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中，培養基每2 d更換1次。將細胞以80%匯合傳代，并以20%匯合接種，保持最佳培養條件。

1.2胃癌微球體細胞培養? 從貼壁細胞（1.0×104/ml）中提取胃癌微球體細胞，置于無血清的PRMI-1640培養基（HyClone）中，培養基含2%B27、20 ng/ml EGF（R&D）、10 ng/ml人FGF-2（R&D）和10 mM HEPES（Invitrogen）。 7～10 d后觀察6孔板中的胃癌微球體細胞，并使用倒置顯微鏡（Olympus）以40和200放大倍數進行定量。胃癌微球體通過胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO）消化，40-μm篩（BD Biosciences）過濾后獲得單細胞懸液，并再次將單細胞接種。最后去除生長因子，添加10%FBS后，從胃癌微球體中獲得分化細胞。

1.3流式細胞術分析和分選? CD44可作為原發性腫瘤和胃癌CSC鑒別標記[9，11-13]。本實驗通過使用FACS分析人MKN-45胃腺癌細胞系的CD44表達模式。通過FACS分選培養CD44+胃癌細胞，誘導腫瘤微球體形成。培養基中加入10%FBS代替EGF和FGF-2，觀測CD44的表達及其形態。步驟如下：蛋白酶消化MKN-45細胞，用PBS洗滌兩次并離心，將1×106個細胞沉淀重懸于含2%FBS的PBS中，使用100倍稀釋的抗人CD44-FITC小鼠單克隆抗體（克隆G44-26，BD Pharmingen）于室溫下，孵育30 min后，在FACS Calibur（Becton-Dickinson）上分析樣品。收集（5～10）×106個細胞并染色，并使用FACS Aria（Becton-Dickinson）分選。選染色最顯著的前10%細胞和最模糊的10%細胞作為陽性和陰性對照組。FACS分選后，使用臺盼藍染色鑒別細胞活性，分選細胞含量預計高于96%。使用CD44小鼠單克隆抗體分析胃癌微球體細胞和分化細胞的CD44表達。

1.4 RT-PCR分析CD44+和CD44-胃癌細胞參與干細胞相關途徑的基因表達情況? 按照試劑盒說明書，使用Trizol試劑（Invitrogen）從CD44+和CD44-細胞中提取總細胞RNA。取1 μg總RNA，通過oligo（dT）18引物，反轉合成cDNA，按照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒說明書進行。反應體系包含：0.1 μM正向和反向引物以及SYBR Green PCR混合物（Applied Biosystems）進行RT-qPCR。具體引物序列如下：CD44正向引物：TCCAGGCAACTCCTAGTAGTA，反向引物：CTGTCCCTGTTGTCGAAT;Wnt2正向引物：ACTCTCAGGACATGCTGGCT，反向引物：ACGAGGTCATTTTTCGTTGG;Bmi1正向引物：TGGAGAAGGAATGGTCCACTTC，反向引物：GTGAGGAAACTGTGGATGAGGA;Notch1正向引物：CCTGAGGGCTTCAAAGTGTC，反向引物：CGGAACTTCTTGGTCTCCAG;Oct4正向引物：CTGGAGAAGGAGAAGCTGGA，反向引物：CAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG;Sox2正向引物：TGCGAGCGCTGCACAT，反向引物：CGGGCAGCGTGTACTTATCC;Nanog正向引物：CAACCAGACCCAGAACATCC，反向引物：TTCCAAAGCAGCCTCCAAG;C-myc正向引物：TCAAGAGGCGAACACACAAC，反向引物：GGCCTTTTCATTGTTTTCCA;ABCG2正向引物：TGGCTTAGACTCAAGCACAGC，反向引物：TCGTCCCTGCTTAGACATCC;CXCR4正向引物：GAGTGGCCGACCTCCTCTT，反向引物：ACATGGACTGCCTTGCATAGG;GAPDH正向引物：ACCCACTCCTCCACCTTTGA，反向引物：CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT。具體操作如下：在95 ℃變性，5 min后，反應在95 ℃下進行40個延伸、擴增循環。通過7900HT快速實時PCR系統（Applied Biosystems）進行信號檢測。以GAPDH基因作為內參，根據2-△△CT法計算目的基因相對表達量。每組重復實驗 3 次，使用Microsoft Excel計算平均值和標準差。

1.5統計學方法 應用SPSS 23.0軟件對所有的實驗數據進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;采用雙側檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1胃泌素形成不同的人胃癌細胞系? MKN-45和NCI-N87細胞顯示直徑約100μm的經典球狀集落，KATOⅢ細胞形成少量集落，而AGS細胞系不能形成球狀集落并死亡，見圖1。

2.2 CD44+干細胞相關基因的表達? MKN-45細胞顯示出高水平的CD44表達，高達82%細胞表達CD44;隨后通過FACS從MKN-45細胞系中分選出CD44+和CD44-細胞，分選的細胞的純度大于96%，見圖2。“腫瘤干性”基因包括CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、轉運蛋白和運動基因（ABCG2、CXCR4），在CD44+中表達高于CD44-細胞亞群，差異有統計學意義（P<0.05），見圖3。相對于CD44-細胞，CD44+細胞形成更多、更大的微球體，差異有統計學意義（P<0.05），見圖4、圖5。CD44+ MKN-45細胞在無血清細胞培養基中培養，以維持未分化狀態，培養10～14 d后，通過倒置相差顯微鏡觀察形成漂浮的微球體，見圖6。此外，胃癌球體在第3次細胞培養傳代后生長為更大、更緊湊的微球體，見圖7。培養1 d后，漂浮的胃微球體遷移為貼壁細胞，貼壁細胞獲得與其親本MKN-45非常相似的多邊形形態，見圖8。流式細胞術分析胃癌微球體和分化的貼壁細胞表明，在分化過程中CD44表達從98%降低至85%，見圖9。

3討論

癌癥干細胞為具有無限增殖、分裂、多向分化潛能的細胞亞群[14]。最早在急性髓性白血病中發現了CSC，其中CD34+ CD38-亞群具有干細胞增殖分化能力[15]，越來越多的證據表明CSCs存在于各種實體腫瘤中，包括乳腺[7]、結腸直腸[16]、肺[17]、頭頸部[18]、胰腺[19]、肝[20]、胃癌[9]、膠質瘤[21]、前列腺[22]等。因此，癌癥干細胞的檢測對癌癥患者的準確診斷和有效治療具有重要意義。尋找細胞表面標志物是鑒定和分離CSC最重要方法，流式細胞術或磁性細胞分選已在許多實體惡性腫瘤中成功分離CSC。然而，實體瘤CSC表面識別標志物的確定無疑是CSC領域最困難的挑戰[6]。大多數用于分選的標記物是經驗性，且源自正常干細胞。最近已有報道分離、鑒定胃CSC的各種技術和細胞表面標志物[13，23-26]，其中CD44是用于胃CSC最具有潛力標記物之一。CD44是Ⅰ類跨膜糖蛋白，可以作為細胞外基質如透明質酸的受體。CD44因其在介導細胞-基質相互作用以及與惡性過程相關的重要功能，尤其是癌癥轉移中的重要作用而備受關注[27]。HA-CD44在細胞外結構域中的相互作用激活了多種信號通路，涉及CSC自我更新、克隆形成、抗凋亡/存活，放化療抗性等[28]。 CD44單獨或與其他標記物組合鑒定CSC已應用于許多腫瘤中，如乳腺癌[7]、胰腺[29]、結腸直腸[30]、肺[31]、肝細胞[32]、卵巢[33]、頭頸部[34]等。Takaishi等通過分析一組人類GC細胞系，在CD44+細胞亞群中鑒定出CSC[9]。與CSC的定義標準一樣，從5個GC細胞系中的3個細胞系中分選出CD44+細胞，在懸浮狀態下形成球狀集落，以及在SCID小鼠的胃和皮膚中形成異種移植腫瘤。因此，本研究試圖通過CD44富集MKN45細胞中收集可能存在的CSC。許多研究人員使用熒光激活細胞分選來鑒定和分離CSCs，確定其在特定的無血清培養基中形成球體。本課題組通過FACS從MKN-45細胞系中分選出CD44+和CD44-細胞，發現CD44+細胞在體外顯示出更高胃癌微球體形成效率，與相關報道結果一致[9]。此外，CD44+細胞能夠在無血清培養基中作為胃癌微球體增殖，并在10%FBS存在下分化，表明它們保留了自我更新能力和分化潛能。

目前研究已在多個癌癥中檢測到干細胞相關基因（也稱為“腫瘤干性基因”），其可解釋CSCs的自我增殖、分化特性[35]。因此，開發有效的診斷、治療方法首先需確定CSC中有活性、特異的分子標志物。據報道，這些基因的失調及其信號通路的變化參與了胃癌的發生發展。通過RT-PCR（qRT-PCR）技術可分析CD44+和CD44-胃癌細胞之間“干性基因”的mRNA表達差異。本研究發現，與CD44-亞群相比，CD44+胃癌細胞群高表達的“干性基因”包括CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、轉運蛋白和運動基因，如ABCG2和CXCR4[36-39]。研發能夠特異阻斷這些與CSC增殖、分化和轉移相關基因的藥物將增強腫瘤的治療效果并改善預后。同時對這些基因進行深入研究，進一步闡明它們對CSCs的確切作用以及其與胃癌的關系具有重要意義。然而，一些胃癌細胞系本身含有高比例的CD44+癌細胞，這與當前的CSC模型不一致，可能與CSC尚未完全純化，且標志物特異性不足有關[40]。本研究中，MKN-45細胞顯示出高水平的CD44表達，高達80%。此外，腫瘤塊內可能存在多個CSC亞群，可能需要多個標記物的組合來識別完整的CSC群體[41]。最近已報道LGR5 +（GPR49+）干細胞位于胃竇區域，持續分化為所有胃竇細胞[42]。本研究還分析了干細胞相關基因LGR5在胃癌細胞系中的表達，但并未發現LGR5在CD44+和CD44-腫瘤細胞中表達的差異。因此，LGR5可能不是胃癌CSC標記。

總之，MKN-45細胞中存在CSC，FACS是分離和鑒定胃癌CSC的有效手段。然而，由于胃CSC的特異性表面標志物未知，異種移植腫瘤模型是鑒定CSCs的金標準，因此需要進一步的DNA高通量測序和體內實驗來鑒定潛在的胃癌干細胞標志物，這可能有助于早期診斷和更有效的胃癌靶向治療。

參考文獻：

[1]Jacques F，Isabelle S，Rajesh D，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].International Journal of Cancer，2015，136（5）：E359-E386.

[2]Yun SS，Han KY.Screening and Early Detection of Gastric Cancer：East Versus West[J].Surgical Clinics of North America，2015，95（5）：1053-1066.

[3]Siegel RL，Fedewa SA，Miller KD，et al.Cancer statistics for Hispanics/Latinos，2015[J].CA：A Cancer Journal for Clinicians，2015.

[4]Beeharry MK，Liu WT，Yan M，et al.New blood markers detection technology： A leap in the diagnosis of gastric cancer[J].World Journal of Gastroenterology，2016，22（3）：12.

[5]Eaves CJ.Cancer stem cells：Here，there，everywhere[J].Nature，2008，456（7222）：581-582.

[6]Woodward WA，Sulman EP.Cancer stem cells： markers or biomarkers[J]Cancer&Metastasis Reviews，2008，27（3）：459-470.

[7]Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100（7）：3983-3988.

[8]Thapa R，Wilson GD.The Importance of CD44 as a Stem Cell Biomarker and Therapeutic Target in Cancer[J].Stem Cells International，2016（2016）：2087204.

[9]Shigeo T，Tomoyuki O，Shuiping T，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44[J].Stem Cells，2010，27（5）：1006-1020.

[10]Weiswald LB，Bellet D，Dangles-Marie V.Spherical Cancer Models in Tumor Biology[J].Neoplasia，2015，17（1）：1-15.

[11]Zhang C，Li C，He F，et al.Identification of CD44+CD24+ gastric cancer stem cells[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011，137（11）：1679-1686.

[12]Yoon C，Park DJ，Schmidt B，et al.CD44 expression denotes a subpopulation of gastric cancer cells in which Hedgehog signaling promotes chemotherapy resistance[J].Clinical Cancer Research，2014，20（15）：3974-3988.

[13]Yu D，Shin HS，Choi G，et al.Proteomic analysis of CD44（+）and CD44 gastric cancer cells[J].Molecular&Cellular Biochemistry，2014，396（1-2）：213-220.

[14]O'Connor，Michael L，Xiang D，et al.Cancer stem cells：A contentious hypothesis now moving forward[J].Cancer Letters，2014，344（2）：180-187.

[15]Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med，1997，3（7）：730-737.

[16]Daisuke I，Takatsugu I，Keisuke M，et al.Colorectal Cancer Stem Cells Acquire Chemoresistance Through the Upregulation of F-Box/WD Repeat-Containing Protein 7 and the Consequent Degradation of c-Myc[J].Stem Cells，2017，35（9）：2027-2036.

[17]Alamgeer M，Peacock CD，Matsui W，et al.Cancer stem cells in lung cancer：Evidence and controversies[J].Respirology，2013，18（5）：757-764.

[18]Jing H，Toshio F，Syed RH，et al.Identification and characterization of cancer stem cells in human head and neck squamous cell carcinoma[J].BMC Cancer，2014（14）：173.

[19]Li C，Heidt DG，Dalerba P，et al.Identification of pancreatic cancer stem cells[J].Cancer Res，2007，67（3）：1030-1037.

[20]Taro Y，Xin WW.Cancer stem cells in the development of liver cancer[J].Journal of Clinical Investigation，2013，123（5）：1911-1918.

[21]Singh SK，Clarke ID，Terasaki M，et al.Identification of a cancer stem cell in human brain tumors[J].Cancer Res，2003，63（18）：5821-5828.

[22]Li T，Su Y，Mei Y，et al.ALDH1A1 is a marker for malignant prostate stem cells and predictor of prostate cancer patients' outcome.[J].Laboratory investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology，2010，90（2）：234-244.

[23]Ishimoto T，Oshima H，Oshima M，et al.CD44+ slow-cycling tumor cell expansion is triggered by cooperative actions of Wnt and prostaglandin E2 in gastric tumorigenesis[J].Cancer Science，2010，101（3）：673-678.

[24]Lau WM，Teng E，Chong HS，et al.CD44v8-10 Is a Cancer-Specific Marker for Gastric Cancer Stem Cells[J].Cancer Research，2014，74（9）：2630-2641.

[25]Fukamachi H，Shimada S，Ito K，et al.CD133 is a marker of gland-forming cells in gastric tumors and Sox17 is involved in its regulation[J].Cancer ence，2011，102（7）：1313-1321.

[26]Nishikawa S，Konno M，Hamabe A，et al.Aldehyde dehydrogenase high gastric cancer stem cells are resistant to chemotherapy[J].International Journal of Oncology，2013，42（4）：1437-1442.

[27]Negi LM，Talegaonkar S，Jaggi M，et al.Role of CD44 in tumour progression and strategies for targeting[J].Journal of Drug Targeting，2012，20（7）：561.

[28]Bourguignon LY，Shiina M，Li JJ.Hyaluronan-CD44 interaction promotes oncogenic signaling，microRNA functions，chemoresistance，and radiation resistance in cancer stem cells leading to tumor progression[J].Advances in Cancer Research，2014，123（22）：255-275.

[29]Ling L，Xinbao H，Jun Q，et al.Antibody Against CD44s Inhibits Pancreatic Tumor Initiation and Postradiation Recurrence in Mice[J].Gastroenterology，2014，6（10）：165.

[30]Dotse E，Bian Y.Isolation of colorectal cancer stem-like cells[J].Cytotechnology，2016，68（4）：609-619.

[31]Leung EL，Fiscus RR，Tung JW，et al.Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties[J].PLoS One，2010，5（11）：e14062.

[32]Michishita M，Ezaki S，Ogihara K，et al.Identification of tumor-initiating cells in a canine hepatocellular carcinoma cell line[J].Research in Veterinary ence，2014，96（2）：315-322.

[33]Meng E，Long B，Sullivan P，et al.CD44+/CD24 ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival[J].Clinical & Experimental Metastasis，2012，29（8）：939-948.

[34]Luciana A，Douglas G，Cristiane S，et al.Profiling the Behavior of Distinct Populations of Head and Neck Cancer Stem Cells[J].Cancers，2016，8（1）：7.

[35]Bhardwaj A，Arora S，Prajapati VK，et al.Cancer"stemness"-regulating microRNAs：role，mechanisms and therapeutic potential[J].Current Drug Targets，2013，14（10）：1175.

[36]Borah A，Raveendran S，Rochani A，et al.Targeting self-renewal pathways in cancer stem cells：clinical implications for cancer therapy[J].Oncogenesis，2015，4（11）：e177.

[37] Es-Haghi M，Soltanian S，Dehghani H.Perspective：Cooperation of Nanog，NF-κΒ， and CXCR4 in a regulatory network for directed migration of cancer stem cells[J].Tumor Biology，2015，37（2）：1559-1565.

[38]Matsuoka J，Yashiro M，Sakurai K，et al.Role of the Stemness Factors Sox2，Oct3/4，and Nanog in Gastric Carcinoma[J].Journal of Surgical Research，2012，174（1）：130-135.

[39]Siddique HR，Saleem M.Role of BMI1，a stem cell factor，in cancer recurrence and chemoresistance：preclinical and clinical evidences[J].Stem Cells，2012，30（3）：372-378.

[40]Rocco A，Compare D，Nardone G.Cancer stem cell hypothesis and gastric carcinogenesis：Experimental evidence and unsolved questions[J].World Journal of Gastrointestinal Oncology，2012，4（3）：54-59.

[41]Brungs D，Aghmesheh M，Vine KL，et al.Gastric cancer stem cells：evidence，potential markers，and clinical implications[J].Journal of Gastroenterology，2016，51（4）：313-326.

[42]Wu C，Xie Y，Gao F，et al.Lgr5 expression as stem cell marker in human gastric gland and its relatedness with other putative cancer stem cell markers[J].Gene，2013，525（1）：18-25.

收稿日期：2020-09-02;修回日期：2020-09-12

編輯/成森