肝細胞癌組織中程序性死亡受體1和T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3的表達及意義

周 舸， 謝麗平， 林濤發， 盧友光， 王少揚

蚌埠醫學院福總教學醫院(解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院) 感染科， 福州 350025

原發性肝癌是全球第六大常見的惡性腫瘤，也是第四大癌癥相關死亡原因[1]。肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌中最常見的病理組織類型(85%～90%)[2]。大部分HCC患者在診斷時已屬晚期，生存預后差，隨著HCC藥物開發的停滯，HCC免疫治療, 特別是免疫檢查點抑制劑的臨床試驗效果及臨床應用有望成為不能手術切除或不適合局部治療患者的一線治療方案[3]。

免疫系統對腫瘤的作用是一個交織復雜的過程，它在殺傷腫瘤細胞的同時，也通過其他機制促使腫瘤細胞的免疫逃逸[4]。失調的免疫系統[包括免疫細胞在功能和(或)數量上的改變，細胞因子水平以及抑制性受體或其配體表達的改變]促成了HCC的發生發展[5]。有研究[6-7]顯示，程序性死亡蛋白1(programmed death-1，PD-1)主要表達于T、B淋巴細胞上，其與配體PD-L1參與形成了腫瘤微環境，可抑制T淋巴細胞的活性和減少細胞因子產生，從而促使腫瘤細胞逃避機體免疫系統的監視和殺傷。T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T lymphocyte immunoglobulin mucin molecule 3，TIM-3)最初在活化的輔助性T淋巴細胞(Th)1表面發現[8]，隨后在樹突狀細胞(DC)、單核細胞、巨噬細胞[8-9]和自然殺傷細胞(NK細胞)[10]等天然免疫細胞表面均發現有TIM-3的表達，TIM-3在這些先天性免疫細胞上的表達上調導致了臨床疾病惡化[10-13]。本研究分析HCC組織中PD-1和TIM-3陽性表達與患者臨床病理參數和預后的關系，旨在探討PD-1、TIM-3在HCC發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇性收集2013年1月-2015年12月于中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院接受手術治療的HCC患者的癌組織及癌旁組織(距腫瘤組織切緣>1 cm)石蠟標本。納入標準：(1)符合原發性肝癌臨床診斷，術后病理證實為HCC；(2)手術初治患者，術前未接受過放化療或其他任何治療；(3)術后生存期≥3個月；(4)臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：(1)合并嚴重心、腦、肺、腎等基礎疾病；(2)合并嚴重感染性疾病；(3)合并自身免疫性疾病；(4)合并其他腫瘤；(5)接受肝移植治療。

1.2 隨訪資料 從術后開始隨訪，在門診及住院記錄中收集所有患者的隨訪信息，配合電話隨訪，隨訪日期截至2019年6月30日，共隨訪1～78個月，直至患者死亡或隨訪截止。統計患者無病生存期(disease free survival，DFS)、總生存期(overall survival，OS)，計算1、3及5年存活率。

1.3 PD-1、TIM-3表達的檢測 應用免疫組化檢測HCC組織及癌旁組織中PD-1、TIM-3的表達情況。所有標本常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片；切片60 ℃烤箱過夜后，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各5 min脫蠟，梯度酒精(100%→90%→80%→70%)水化；使用EDTA法修復抗原；畫圈標注，PBS洗滌3次，3%H2O2浸泡10 min后PBS洗滌3次，滴加山羊血清封閉10 min；滴加一抗(PD-1、TIM-3的最佳稀釋濃度分別為1∶50、1∶500)37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，滴加反應增強液(20 min)后滴加二抗室溫孵育30 min；PBS洗滌3次，DAB顯色5 min，自來水終止顯色，蘇木素復染；酒精鹽酸溶液分化5 s，自來水中沖洗20 min藍化；無水酒精脫水，中性樹脂封片。隨機選取5個200倍視野，每個視野均進行染色強度計分與陽性百分比計分，根據陽性細胞所占比例和染色強度綜合判斷PD-1、TIM-3陽性表達。染色強度以多數細胞呈現的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞百分比即某類細胞5個視野的陽性細胞平均數：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩項評分乘積0分為陰性(-)、1～4分為弱陽性(+)、5～8分為中度陽性(++)、9～12分為強陽性(+++)。所有切片結果均由兩名病理科醫師獨立雙盲下完成結果判讀。分析二者表達水平與患者臨床病理參數的關系。

1.4 倫理學審查 本研究經中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院倫理委員會審核(批號：2018-019)，患者或家屬均知情同意。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，配對等級資料的比較采用Wilcoxon檢驗，等級資料的相關性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，log-rank檢驗比較組間生存率差異，采用Cox回歸分析模型進行多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共收集HCC患者46例，HBsAg均為陽性；其中男39例，女7例；年齡26～71歲，平均(48.50±13.42)歲，其中<50歲者22例，≥50歲者24例；腫瘤直徑<5 cm者23例，≥5 cm者23例；腫瘤單發病灶39例，多發病灶7例；有門靜脈癌栓者18例，無門靜脈癌栓者28例；病理分化程度：高分化5例，中分化30例，低分化11例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期5例；臨床分期：Ⅰ期38例，Ⅱ期8例。所有患者的OS為5～78個月，1、3及5年總生存率分別為89.1%、56.5%和34.4%，平均OS(45.36±3.87)個月；所有患者的DFS為0～78個月，1、3及5年無病生存率分別為52.2%、21.7%和10.9%，平均DFS為(23.41±3.52)個月。其中30例(65.22%)死亡，其OS為5～56個月，平均OS為40.69個月；41例(89.13%)復發或轉移，其DFS為0～54個月，平均DFS為21.78個月。

2.2 PD-1和TIM-3在HCC組織及癌旁組織中的表達情況 PD-1陽性表達主要定位于淋巴細胞的細胞膜或細胞質，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀(圖1、2)；TIM-3陽性表達主要定位于肝竇內Kupffer細胞的細胞膜或細胞間質，呈淺黃色至棕褐色(圖3、4)。HCC組織中PD-1陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性表達率分別為26.09%(12/46)、26.09%(12/46)、41.30%(19/46)、6.52%(3/46)，癌旁組織中PD-Ⅰ陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性表達率分別為60.87%(28/46)、34.78%(16/46)、4.35%(2/46)、0(0/46)，二者比較差異有統計學意義(Z=-4.612，P<0.01)；HCC組織中TIM-3陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性表達率分別為8.70%(4/46)、39.13%(18/46)、39.13%(18/46)、13.04%(6/46)，癌旁組織中TIM-3陰性、弱陽性、中度陽性、強陽性表達率分別為15.22%(7/46)、60.87%(28/46)、21.74%(10/46)、2.17%(1/46)，二者比較差異有統計學意義(Z=-3.203，P<0.01)。HCC組織中PD-1和TIM-3的表達水平具有相關性(rs=0.397，P=0.006)。

2.3 HCC組織PD-1、TIM-3表達與患者臨床病理參數的關系 HCC組織中PD-1表達強弱與腫瘤大小、門靜脈癌栓和TNM分期有關(P值均<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤數目、病理分化程度和臨床分期無關(P值均>0.05)。 HCC組織中TIM-3的表達強弱與門靜脈癌栓、病理分化程度和TNM分期有關(P值均<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數目和臨床分期無關(P值均>0.05)(表1)。

注：a，中度陽性；b，弱陽性；c，陰性。未見強陽性表達。

注：a，強陽性；b，中度陽性；c，弱陽性；d，陰性。

表1 PD-1、TIM-3表達與HCC患者臨床病理參數的關系

注：a，強陽性；b，中度陽性；c，弱陽性；d，陰性。

2.4 HCC組織中PD-1、TIM-3的表達與患者預后的關系 截至最終隨訪日，46例患者中無1例失訪，隨訪率100%。HCC組織中PD-1不同表達水平組的OS比較差異有統計學意義(χ2=8.132，P=0.043)；TIM-3不同表達水平組的OS比較，差異無統計學意義(χ2=2.077，P=0.557)，PD-1、TIM-3不同表達水平組的DFS比較，差異均無統計學意義(χ2值分別為4.491、2.072，P值均>0.05)。

單因素分析顯示腫瘤大小(χ2=10.238，P=0.001)、病理分化程度(χ2=13.939,P=0.001)、TNM分期(χ2=27.929，P<0.001)是影響患者術后OS的預后因素；病理分化程度(χ2=14.764,P=0.001)、TNM分期(χ2=18.137，P<0.001)是影響患者DFS的預后因素。多因素分析結果顯示，病理分化程度(HR=4.723，95%CI：1.618～7.684，P=0.001)、腫瘤大小(HR=3.234，95%CI：1.327～7.883，P=0.010)、TNM分期(HR=3.254，95%CI：1.076～9.835，P=0.037)、TIM-3的表達水平(HR=0.572，95%CI：0.329～0.995，P=0.048)均是HCC患者OS的獨立預后因素；病理分化程度(HR=2.945，95%CI；1.527～5.682，P=0.001)、TNM分期(HR=2.074，95%CI：1.259～9.793，P=0.016)均是HCC患者DFS的獨立預后因素。

3 討論

HCC是一類由多種因素導致的惡性腫瘤，其免疫學發病機制十分復雜。這些機制包括肝癌免疫微環境中抗原呈遞和免疫效應功能的紊亂，免疫檢查點分子的改變，以及細胞因子譜的紊亂[14]。免疫系統在發揮抗腫瘤免疫的同時，也通過免疫編輯對腫瘤細胞的一些生物學特性(如腫瘤表面分子表達、腫瘤的抗原性等)進行了重塑，促進了腫瘤細胞的惡性生長、轉移、擴散[4]。由于獨特的雙重脈管系統，肝臟大量接觸腸道病原體和外源性非致病分子，為防止自身免疫性肝損傷的發生，肝臟形成了強大的免疫耐受微環境[14]。在肝臟的免疫耐受微環境中，腫瘤通過免疫系統的負調節因子，抑制機體免疫系統及其效應因子，從而逃避T淋巴細胞免疫應答和宿主免疫反應[15-17]。

PD-1是B7/CD28家族的成員[18]，在正常生理條件下，PD-1的主要功能是通過與其配體結合，抑制效應T淋巴細胞的功能，促進調節性T淋巴細胞(Treg)的功能和發育，進而防止外周組織中免疫反應的過度激活，從而保護宿主免于自身免疫應答[19-20]。HCC組織中腫瘤浸潤淋巴細胞上的PD-1與其在腫瘤細胞表面的配體結合，參與形成了腫瘤抑制微環境，可抑制T淋巴細胞對癌細胞的殺傷作用，減少細胞毒性分子和細胞因子的產生，促進Treg的功能，改變了T淋巴細胞與DC或靶細胞接觸范圍，從而促使腫瘤細胞逃避機體免疫系統的監視和殺傷，而抑制PD-1信號通路則可增強內源性抗腫瘤免疫效應，減少腫瘤浸潤和轉移[6-7,21]。TIM-3屬于TIM家族，是TIM-3家族的典型成員[22]，TIM-3被認為與CD8+T淋巴細胞功能障礙和衰竭有關，近年來巨噬細胞上表達TIM-3的機制也受到了關注。腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)代表著與癌癥炎癥相關的主要炎癥細胞[23]。在浸潤性腫瘤中，TAMs朝著一個以表達免疫調節因子(如IL-10和TGFβ)和弱抗原遞呈能力為特征的M2表型分化[24]。2007年Science報道，TIM-3高表達于巨噬細胞，并通過NF-κB促進巨噬細胞的炎癥反應。腫瘤微環境中的TGFβ能促使巨噬細胞表達TIM-3[25]。有研究[26]結果顯示，在HCC中，TIM-3能促使TAMs向M2型分化，TIM-3通過NF-κB/IL-6通路促使TAMs產生適宜腫瘤生長的IL-6，干擾TIM-3能顯著抑制TGFβ誘導的巨噬細胞M2極化，此時的巨噬細胞表現為IL-10分泌降低、IL-12生成增多。

Li等[27]發現HCC組織中PD-1和TIM-3的表達呈正相關，腫瘤鄰近組織中PD-1和TIM-3的表達也呈正相關，而肝硬化組織中PD-1和TIM-3表達沒有相關性。本研究發現，HCC組織中同時存在PD-1和TIM-3的高表達，兩者的表達水平呈正相關，這與Li等[27]的結論相似。TIM-3在TAMs中表達較多，在HCC組織中的表達水平高于癌旁組織。這與閻文江等[26]報道的結果類似。HCC組織中PD-1的表達水平與腫瘤大小、有無門靜脈癌栓和TNM分期有關，而與患者性別、年齡、腫瘤數目、病理分化程度和臨床分期無關；TIM-3的表達水平與門靜脈癌栓、病理分化程度和TNM分期有關，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數目和臨床分期無關。

本研究還發現，PD-1不同表達水平組之間的OS有差異，TIM-3不同表達水平組之間的OS無明顯差異。TIM-3是HCC患者OS的獨立預后因素，但不是DFS的獨立預后因素，而PD-1均不是HCC患者OS和DFS的獨立預后因素，這可能與樣本量小，患者基線特征的差異性等因素有關。

綜上所述，HCC癌組織中PD-1、TIM-3的高表達與疾病的進展和不良預后有關。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：周舸負責課題設計，資料分析，撰寫論文；王少揚對文章知識性內容作出批評性審閱并修改論文；林濤發參與收集數據；謝麗平、盧友光給予技術及材料指導。