噬菌體在酒精性肝病治療中的應用

馬 歡， 佟 靜， 王炳元

1 錦州醫科大學附屬第一醫院 消化內科， 遼寧 錦州 121000； 2 中國醫科大學附屬第一醫院 消化內科， 沈陽 110001

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)是酒精相關性肝病(alcohol-associated liver disease, ALD)中比較嚴重的一個類型，部分發生在肝硬化的基礎上，病死率高達40%，除了肝移植，缺乏有效的治療方法[1-2]。Maddrey判別函數(maddrey discriminant function, mDF)>32，30天病死率超過30%[3]。即使mDF<32，經活檢證實的酒精性脂肪性肝炎患者1年病死率也高達20%，5年為50%[4]。國外推崇的類固醇激素在STOPAH(steroids or pentoxifylline in alcoholic hepatitis)實驗中，3個月或1年也沒有任何生存獲益，而且還增加患者的感染率[5]。最近的一項研究[6]揭示了腸道糞腸球菌分泌的外毒素——溶細胞素是AH發生的一個重要因素，利用噬菌體靶向消滅含溶細胞素的糞腸球菌，顯著改善了AH的預后，為臨床提供一種治療AH的新選擇。綜合相關文獻，對噬菌體、溶細胞素和AH的關系作一簡要介紹。

1 腸道菌群與ALD

乙醇的脂溶性和毒性可直接破壞腸黏膜屏障，特別是黏膜機械屏障的破壞導致患者腸道通透性增加(滲漏)和腸道微生物(16sRNA、病毒、真菌或細菌等)或細菌代謝產物(內毒素, 溶細胞素等)移位，經門靜脈系統到達肝臟，由病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)激活肝臟的免疫系統，引起Kupffer細胞和中性粒細胞大量趨化外，也明顯增加外周和肝臟T淋巴細胞亞群及自然殺傷T淋巴細胞數量，導致肝細胞壞死、凋亡和/或焦亡。肝細胞損傷又引起損傷相關分子模式的釋放，后者通過與PAMP類似的方式增強肝臟的炎癥反應[7]。炎癥的持續存在和級聯反應增強，導致全身炎癥反應綜合征，后者進一步加重腸道通透性，持續不斷的細菌移位再加重肝臟的炎癥，形成惡性循環[8]。

2 噬菌體

噬菌體是能夠感染和專門破壞細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱[9]。最近在人類腸道微生物群中發現了一種非常豐富的噬菌體(crAssphage)，在嬰兒出生1個月后就可以通過母嬰傳播，使嬰兒腸道中的菌株多樣性隨時間而增加[10]。噬菌體在吸附和侵入宿主細胞(細菌)后，既能進行溶源循環，還能進行裂解循環[11]。溶源循環的特征是噬菌體與宿主基因組的整合(垂直傳播)，裂解循環造成宿主細胞的裂解和噬菌體的釋放(水平傳播)。同源裂解噬菌體不僅直接影響易感菌，而且通過細菌間相互作用對其他細菌產生連鎖效應[12]。某些噬菌體只能通過一個裂解循環來繁殖，在這個生命周期中它們會爆發并殺死宿主細胞。盡管噬菌體通常表現出一個窄譜的宿主范圍，但可以作為基因轉移載體，極大地影響著宿主基因的水平或垂直轉移，為克服耐藥菌株的治療提供了挑戰和機遇[13]。

應用現代各種生物學技術“修飾”的噬菌體越來越多地被用于細菌感染或細菌耐藥(或抗性)的臨床研究。利用基因組工程和正向遺傳學技術，開發出高效殺傷感染性膿腫分枝桿菌的裂解噬菌體衍生物[14]；將水凝膠包裹銅綠假單胞菌噬菌體運送到骨感染部位，7天后感染部位的綠膿桿菌活菌數下降了4.7倍[15]；應用測序和基因組分析的方法，分離出能夠控制耐肺炎克雷伯菌的噬菌體vB_KpnP_IME337，其可能是一個有希望的抗生素治療替代品[16]；通過抗體特異性工程的方法，對噬菌體尾纖維蛋白中的宿主范圍決定區進行基因工程改造，合成具有改變特定宿主的噬菌體，不僅能夠長期抑制細菌生長，還能減緩耐藥菌的發生[17]。

3 溶細胞素

一些噬菌體要借助溶細胞素才能裂解特定細胞群 (如細菌、腫瘤)[18]。溶細胞素是一種類似外毒素的物質，毒性很強。含有溶細胞素的細胞以水溶性單體的形式分泌溶細胞素，通過由D4結構域的L1環中的Thr-Leu識別細胞膜上的膽固醇受體，與膽固醇結合形成膽固醇依賴性溶細胞素(cholesterol-dependent cytolysins, CDC)[19]。CDC通過在細胞膜上形成溶孔參與疾病發展的各個階段，從細胞直接死亡到細胞功能受損[20]。CDC形成的弓形結構被插入到脂質雙層中形成孔是造成細胞損傷的主要機制。孔中的Na+導電性導致離子流入，超過Na+/K+泵擠出Na+的能力，使細胞內滲透壓的凈負荷增加導致受攻擊細胞腫脹和最終溶解[21]。細胞環境pH值、細胞膜膽固醇的濃度和溶細胞素的濃度等可能影響CDC靶細胞的活性和功能[19]。膽固醇的可及性是膜保護的重要機制，膽固醇的暴露受磷脂頭基和酰基鏈結構的調節，緊密堆積的磷脂降低了膽固醇暴露，而松散堆積的磷脂提高了CDC的膽固醇利用率[19]。

4 溶細胞素與AH

健康的人類腸道中腸球菌(包括糞腸球菌)的數量很少，但AH患者糞便樣本中糞腸球菌的數量可達健康人群腸道的2700倍以上。30%的糞腸球菌菌株有一種編碼外毒素的溶細胞素基因，具有這些特殊基因的糞腸球菌才是導致患者肝病進展和死亡的關鍵因素[1,6]。糞便中溶細胞素編碼基因與國際標準化比值、血小板計數、終末期肝病模型(MELD)評分、MELD-鈉評分、年齡、血清膽紅素、國際標準化比值和血清肌酐之間存在相關性，而且也與90天(P=0.004)和180天病死率(P=0.001)相關。糞便標本中含有溶細胞素的AH患者，89%在入院后180天內死亡，72.2%的死亡患者以肝衰竭(包括胃腸道出血)為死因，而糞便樣本中缺少溶細胞素的AH患者中僅有3.8%死亡。對90天病死率進行受試者工作特性曲線分析時，溶細胞素的受試者工作特征曲線下面積為0.81，這說明其優于臨床實踐中其他廣泛使用的病死率預測因子[6]。移植了含有溶細胞素的AH患者糞便中菌群的人源化無菌小鼠表現出一定的肝損傷和肝細胞死亡跡象，而移植了缺失溶細胞素的小鼠并未表現出肝損傷的跡象[6]。

與AH中觀察到的情況相反，96例非酒精性脂肪性肝病患者中只有7例糞便溶細胞素陽性，與溶細胞素陰性患者相比，肝細胞活動性炎癥沒有增加。即攜帶溶細胞素的糞腸球菌只特異性地影響AH患者的臨床結局[21]。

5 噬菌體治療AH

與對照組相比，AH患者糞便中糞腸球菌數量增加，溶細胞素陽性的糞腸球菌的存在與肝病的嚴重程度和病死率相關[6]。在以溶細胞性糞腸球菌為靶點的噬菌體治療中，發現這些噬菌體降低了人源化小鼠肝臟中溶細胞素，并消除了ALD[6]。溶細胞素不僅對革蘭陽性球菌有溶解活性，而且對真核細胞也有溶解活性[6]。但是這些病毒顆粒的優勢主要在于它們對單一宿主細胞的靶向性[18]。噬菌體能夠特異性地靶向溶細胞性糞腸球菌，為精確編輯腸道菌群提供了一種方法。目前僅有這一篇高質量的文獻[2]針對人源化小鼠肝臟中溶細胞素的噬菌體治療，為了驗證這個特殊發現與人類AH的相關性，并檢驗這種新的治療方法對患者是否有效，仍需要一個更大隊列的前瞻性臨床試驗。

6 噬菌體治療ALD的展望與問題

盡管在過去50年中進行了廣泛的研究，嚴重AH的治療仍然是一個臨床挑戰，除器官移植外，幾乎無有效的治療選擇[2-3]，由于供體肝臟儲量不足，以及相關規定禁止那些尚未戒酒的人進行移植，許多人最終只能等待死亡。應用環境資源(污水)中，可以很容易地分離出針對溶細胞素陽性糞腸球菌的噬菌體，初步嘗試對AH的治療就取得了顯著的效果，以此為契機，今后可能將ALD的研究推向一個令人鼓舞的方向[1,6]。糞便溶細胞素的測定既可作為AH嚴重程度的的生物標志物，又可以作為篩選噬菌體治療的預測指標[1]。

噬菌體療法用于AH的治療，超出了原有噬菌體職責——治療抗生素耐藥菌的范圍，給研究者增加了無數個需要解決的難題。但這一開創性的研究結果也提供了一種AH新的病理機制和潛在的生物標志物，給病死率較高的重度AH的治療增加了一個新選擇，且帶來了機遇和挑戰。

作者貢獻聲明：馬歡、佟靜等負責設計和撰寫論文；王炳元負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。