放射性核素標記HER2抗體和納米抗體的分子影像研究進展

宋宏杰，周治國，宋少莉，王明偉

1. 復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；

2. 復旦大學生物醫學影像研究中心，上海分子影像探針工程技術研究中心，上海 200032；

3. 復旦大學核物理與離子束應用教育部重點實驗室，上海 200433；

4. 上海師范大學化學與材料科學學院，上海 200234

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是酪氨酸激酶受體蛋白，已發現HER2高表達在許多癌癥類型中對細胞分化、增殖和預后起關鍵作用[1]。研究發現：20%～30%的乳腺癌[2]，20%的胃癌或胃食管交界癌[3]，5%～15%的膀胱癌[4]，5%～15%的宮頸癌[5]，12%～15%的膽囊癌[6]，8%～35%的子宮內膜癌[7]，6%～7%的卵巢癌[8]和15%～37%的唾液腺癌[9]HER2呈陽性。因此，HER2表達檢測對于癌癥的診斷和治療非常重要，特別是具有定性/定量和全身顯像特點的HER2靶向性分子影像，能夠同時檢測原發灶、單/多轉移灶和治療過程中HER2表達動態變化。

為了發展有效的HER2分子影像檢查方法，包括抗體[10]、肽[11-12]和適配體[13-14]等在內的HER2靶向性生物分子均有相關的研究報告。其中，曲妥珠單抗（trastuzumab，TzAb）是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的一種人源化單克隆抗體，能夠結合HER2的細胞膜外區并抑制其功能[15]，基于該抗體的分子影像研究相對較多。然而，完整抗體的相對分子質量較大（約150×103），導致血液循環時間長，達到最佳顯像效果的時間通常在注射后3～7 d，臨床應用有一定的局限性。納米抗體是天然存在的最小抗原結合片段，相對分子質量小，僅為10×103～15×103，只是完整抗體的1/10，并且有穩定性高、易于生產等優勢，在分子影像領域的應用已經逐漸興起[16-20]。本文主要綜述放射性核素標記HER2完整抗體和納米抗體的分子影像探針及其單光子發射計算機斷層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）/電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、正電子發射斷層成像（positron emission tomography，PET）/CT顯像的研究進展。

1 基于高相對分子質量HER2單克隆抗體的核素分子影像

至今各類放射性核素標記靶向HER2的單克隆抗體已有很多研究。例如，64Cu[21-24]、18F[25-26]、89Zr[27-30]、99mTc[31-32]、111In[33-35]、131I[36-37]等核素標記的TzAb和帕妥珠單抗（pertuzumab，PzAb）處子不同的研究階段，利用SPECT/CT或PET/CT顯像可在體內檢測腫瘤組織HER2表達水平。

1.1 核素標記TzAb及其SPECT/CT和PET/CT分子影像

TzAb是與HER2的細胞膜外結構域Ⅳ結合的重組人源化單克隆抗體[38]。放射性核素標記TzAb的臨床前和臨床研究都已經取得進展，能夠使HER2陽性腫瘤病灶顯像。為了利用SPECT/CT顯像HER2表達，Price等[33]將螯合劑p-SCN-Bn-H4octapa｛N，N’-[（羧酸基）甲基]-N，N’-[（6-羧酸基）吡啶（2-基）甲基]-1-（對芐基-異硫氰酸基）-1，2-二氨基乙烷｝與TzAb偶聯發展了新型HER2靶向抗體復合物H4octapa-Tz，并在溫和的條件下（15 min，室溫）實現了顯像核素111In和治療核素177Lu標記，以較高的放射化學標記率（94%～95%）獲得了111In-octapa-TzAb和177Lu-octapa-TzAb（圖1），研究者以SKOV-3卵巢癌移植瘤小鼠為實驗模型，獲得了111In-octapa-TzAb和177Luoctapa-TzAb SPECT/CT圖像，均能清楚顯像腫瘤部位（圖1），二者分別于注射120和96 h后腫瘤攝取達到最大值[（72.4±21.3）%ID/g和（70.4±25.8）%ID/g]。該研究結果表明111In標記TzAb的HER2表達SPECT/CT顯像具有很好的應用前景。隨后，Gaykema等[35]報道TzAb治療中HER2陽性轉移性乳腺癌111In-TzAb SPECT顯像具有可行性，發現治療后111In-TzAb的腫瘤攝取值明顯降低。

由于PET/CT顯像的優勢更加明顯，利用半衰期較長的正電子核素標記TzAb PET/CT顯像HER2表達的研究更受關注。Tamura等[23]以DOTA為螯合劑，制備了核素64Cu標記的HER2顯像探針64Cu-DOTA-TzAb，并開展了HER2陽性乳腺癌患者64Cu-DOTA-TzAb PET/CT顯像、安全性和內輻射劑量研究，該研究發現，注射后48 h是評價腫瘤攝取64Cu-DOTA-TzAb的最佳時間點，而且獲得了乳腺癌原發灶和腦轉移灶的高對比度的PET/CT顯像（圖2），其輻射劑量與常用的18F-FDG相當，具有較好的安全性。

1.2 核素標記帕妥珠單抗（pertuzumab，PzAb）及其SPECT/CT和PET/CT分子影像

如同TzAb一樣，PzAb是靶向HER2的另一種單克隆抗體，其結合于HER2的細胞膜外亞結構域Ⅱ。放射性核素標記PzAb及其HER2表達分子影像的臨床前和臨床研究同樣取得了良好的進展。McLarty等[34]于2009年報道111In-DTPA-PzAb micro SPECT/CT顯像可靈敏地檢測乳腺癌模型HER2表達變化，研究者首先通過體外SKBR-3細胞飽和結合實驗測量111In-DTPAPzAb的Kd和Bmax分別為（2.0±1.0）nmol/L和（1.2±0.2）×106受體/細胞。MDA-MB-361腫瘤模型體內micro SPECT/CT顯像表明，腫瘤部位顯像清晰，而且能夠動態監測TzAb治療后導致的HER2表達降低（圖3）。后來，他們又發展了用于制備111In-DTPA-PzAb的試劑盒，更加方便開展相關的臨床研究[39]。

為了開展基于PzAb的HER2表達PET/CT顯像研究，Jiang等[24]于2017年報道64Cu-DOTAPzAb micro PET可顯像卵巢癌HER2表達。他們選擇了3種卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3 和Caov3，開展64Cu-DOTA-PzAb的體外細胞結合實驗，結果顯示其與SKOV3細胞具有高的特異度[Ka=（3.1±0.6）nmol/L]。進一步micro PET顯像結果表明，注射后48 h，3種腫瘤組織的64Cu-DOTA-PzAb攝取值分別為（41.8±3.8）、（10.5±3.9）和（12.1±2.3）%ID/g，且能清晰檢查轉移灶（圖4）。2018年Ulaner等[30]報道89Zr-PzAb PET/CT可顯像乳腺癌患者體內HER2表達，并首次開展臨床應用和輻射劑量研究，該研究入組了6例HER2陽性轉移性乳腺癌患者，注射89Zr-PzAb后均沒有毒性發生，全身平均有效劑量為（0.54±0.07）mSv/MBq。89Zr-PzAb的最佳顯像時間點為注射后5～8 d，其PET/CT顯像能夠檢查到多個HER2陽性病灶和腦轉移灶（圖5）。

圖1 111In-octapa-TzAb（左）和177Lu-octapa-TzAb（右）SPECT/CT顯像及octapa-TzAb的結構（中）

圖2 64Cu-DOTA-TzAb結構和腫瘤患者PET/CT顯像

圖3 111In-DTPA-PzAb結構和腫瘤模型SPECT/CT顯像

圖4 64Cu-DOTA-PzAb結構和腫瘤模型PET/CT顯像

圖5 89Zr-PzAb結構和腫瘤患者PET/CT顯像

2 基于低相對分子質量HER2納米抗體的核素分子影像

基于納米抗體的腫瘤分子影像和診療應用是新興研究領域，其中放射性核素標記HER2納米抗體是非?；钴S的一個研究領域。不同的放射性核素標記的靶向HER2納米抗體及其應用見表1。

表1 核素標記HER2納米抗體與應用

2.1 單光子核素標記HER2納米抗體及其SPECT/CT分子影像

2.1.199mTc標記HER2納米抗體及其SPECT/CT顯像

Vaneycken等[40]于2011年制備了靶向HER2的38種納米抗體，通過體外生化表征和細胞結合實驗評價，發現2Rs15d納米抗體穩定性好，能選擇性與HER2蛋白和HER2陽性細胞結合，親和力為納摩爾水平，且與TzAb和PzAb不存在競爭關系，是HER2陽性腫瘤的新型生物靶向分子。他采用[99mTc(H2O)3(CO)3]標記2Rs15d的方法，獲得對應的分子影像探針99mTc-2Rs15d。其HER2陽性腫瘤模型的SPECT/CT顯像定量和生物分布分析表明，99mTc-2Rs15d腫瘤攝取高，血液清除快，非靶器官積累低（腎臟除外）。注射后1 h，腫瘤/血液（T/B）與腫瘤/肌肉（T/M）的比值均已很高，腫瘤顯像對比度清晰（圖6）。

2.1.2111In標記HER2納米抗體及其SPECT/CT顯像

位點特異度標記是發展基于抗體的分子影像探針的挑戰和難點，納米抗體也面臨同樣的問題。Massa等[43]于2014年通過硫醚鍵方法開發了位點特異度標記納米抗體的通用策略，研究者在他們前期研究HER2納米抗體的基礎上，選擇His標簽化2Rs15d（2Rs15d-H）為實驗對象，為了避免干擾抗原結合能力，在其羧基端依次引入連接子（Linker）和半胱氨酸（Cys）構建新的衍生物2Rs15d-HLC。在溫和的還原劑存在條件下，他們進一步將2Rs15d-HLC與含有馬來酰亞胺基團的螯合劑maleimide-DTPA螯合，實現了核素111In標記，得到新的SPECT/CT顯像探針111In-DTPA-2Rs15d-HLC，并與隨機標記得到的111In-CHX-A″-DTPA-2Rs15d-H進行比較。體外生化性質實驗表明， DTPA-2Rs15d-HLC的化學組分單一，結構式和相對分子質量明確，與HER2的親和力保持在納摩爾水平。其體內HER2陽性SKOV3腫瘤SPECT/CT顯像顯示，腫瘤組織吸收高，肝、肺等正常組織攝取值較低，體內穩定性良好（圖7）。

圖6 99mTc-2Rs15d的標記反應和腫瘤模型SPECT/CT顯像

圖7 111In-DTPA-2Rs15d-HLC的結構和腫瘤模型SPECT/CT顯像

2.2 正電子核素標記HER2納米抗體及其PET/CT分子影像

2.2.168Ga標記HER2納米抗體及其PET/CT顯像

核素68Ga可以通過68Ge/68Ga發生器獲得，來源較為便利，同時半衰期短（t1/2=68 min），適用于標記多肽和納米抗體等血液清除快、相對分子質量小的靶向性生物分子，與其相關的PET/CT顯像報道越來越多。前文講述的納米抗體2Rs15d結構中均含有His6標簽，它是為了便于分離純化而在生產期間引入的。然而，對于人體內應用，這些富含組氨酸標簽的融合蛋白可能存在免疫原性的風險[49-50]，需要考慮去掉His6標簽。Xavier等[46]于2013年報道，納米抗體2Rs15dHis6和2Rs15d與螯合劑NOTA連接后，可以實現快速高效的68Ga標記，生成HER2表達PET/CT顯像探針68Ga-NOTA-2Rs15dHis6和68Ga-NOTA-2Rs15d。在pH為5的條件下，室溫反應5 min，它們的標記率達到97%以上，比活度為55～200 MBq/nmol。生物分布研究顯示，這兩種探針均能快速、特異地積聚于HER2陽性腫瘤部位，其注射后1 h腫瘤攝取值分別為（3.13±0.06）和（4.34±0.90）%ID/g，并有很高的腫瘤/血液（T/B）和腫瘤/肌肉（T/M）的比值，因而獲得高對比度PET/CT圖像（圖8）。該研究報道了兩個非常重要的發現：不含His6標簽的探針68Ga-NOTA-2Rs15d的腎臟攝取減少60%；注射抗體的質量顯著改變其整體的生物分布，即NOTA-2Rs15d的質量增加100倍，肝臟攝取值從（7.43±1.89）%ID/g降低到（2.90±0.26）%ID/g，而腫瘤攝取值從（2.49±0.68）增加到（4.23±0.99）%ID/g。

隨后不久，該課題組就開展了68Ga-2Rs15d PET/CT顯像檢測乳腺癌患者HER2表達的Ⅰ期臨床試驗研究[17]。該項臨床研究入組22例HER2評分2+或3+的原發或轉移性乳腺癌患者，注射53～174 MBq68Ga-2Rs15d后進行PET/CT顯像。研究結果表明，所有患者均沒有發生不良反應，68Ga-2Rs15d的血液清除較快，注射1 h后血液的放射性活度只有注射量的10%，正常組織器官的吸收主要見于腎臟、肝臟和小腸，有效劑量為0.043 mSv/MBq，平均每人的吸收劑量為4.6 mSv。68Ga-2Rs15d PET/CT顯像可以檢測腫瘤組織（圖9），該探針在原發腫瘤的積聚變化范圍較大，而在轉移性腫瘤組織的積聚都在本底之上，其臨床應用需要進一步的驗證。

圖8 68Ga-NOTA-2Rs15d的結構和腫瘤模型PET/CT顯像

圖9 腫瘤患者68Ga-NOTA-2Rs15d PET/CT顯像

2.2.218F標記HER2納米抗體及其PET/CT顯像

18F由醫用回旋加速器生產，獲得便利，產量較高，半衰期（t1/2=109.7 min）合適，已有多樣化的標記方法，是目前用于PET/CT顯像最廣泛的正電子核素。18F標記的PET顯像探針在臨床和臨床前分子影像領域均是最有代表性的、最成功的應用，特別是18F-FDG PET/CT的普及，18F標記HER2顯像探針自然會成為重要的研究方向。在前期工作的基礎上，Xavier等[48]采取最常用的18F標記輔基18F-SFB與納米抗體2Rs15d偶聯的方法，制備得到HER2顯像探針18F-FB-2Rs15d，開展了其體內生物分布和腫瘤顯像研究。18F-FB-2Rs15d的放射化學產率為5%～15%（衰變校正之后），比活度為（24.7±8.2）MBq/nmol。體內生物分布和PET/CT顯像實驗表明，該探針腎臟清除快，在HER2陽性腫瘤內高特異度積聚，注射1和3 h后腫瘤攝取分別為（25.94±1.17）和（3.74±0.52）%ID/g，進而獲得高對比度的腫瘤圖像（圖10）。與此同時，Vaidyanathan等[47]報道了18F標記另一種HER2靶向納米抗體5F7的臨床前評價研究，研究者利用兩種18F標記方法，即兩種輔基18F-SFB和18F-RL-I分別與5F7偶聯，制備對應的PET顯像探針18F-FB-5F7和18F-RL-I-5F7，評價其體內外生物學性質和顯像效果。實驗結果表明，18F-RL-I-5F7在HER2陽性細胞中內化程度高于18F-FB-5F7，注射1和2 h后前者在BT474M1腫瘤內攝取值分別為（28.97±3.88）和（36.28±14.1）%ID/g，顯著高于后者，然而，前者在腎臟內分布是后者的28～36倍。同時，18F-RL-I-5F7 PET/CT可以清晰顯像HER2陽性腫瘤，并能被TzAb阻斷，說明其HER2特異性（圖10）。

圖10 18F-FB-2Rs15d和18F-RL-I-5F7結構和腫瘤模型PET/CT顯像

3 結論和展望

核素分子影像即SPECT/CT和PET/CT顯像在腫瘤精準診斷和治療中的作用越來越重要。因此，本文綜述了核素標記HER2完整抗體和納米抗體的分子影像探針及其HER2陽性腫瘤SPECT/CT和PET/CT顯像的研究進展。HER2抗體TzAb和PzAb均是成功的臨床藥物，臨床上體內HER2表達顯像的需求非常明確，與之相應，核素標記TzAb和PzAb開始較早，有關的SPECT/CT和PET/CT顯像的臨床試驗較多，臨床應用前景很好。特別是隨著半衰期較長的新型正電子核素64Cu和89Zr的出現，更加有利于基于HER2抗體的PET/CT顯像的臨床轉化研究和應用。然而，其最佳腫瘤顯像時間是注射后3～5 d，這是其主要的局限性。與之相比，基于納米抗體的藥物尚處于臨床試驗和初期應用階段，相應的核素標記HER2納米抗體的研究起步較晚。由于相對分子質量小、血液清除快，核素標記HER2納米抗體具有注射后“1 d內”及時顯像的特別優勢，因此其臨床前和臨床研究的進展較快，均已取得積極的結果。需要指出的是，HER2納米抗體的生物半衰期與核素68Ga和18F的物理半衰期較為匹配，再加上PET/CT顯像的固有優勢，68Ga和18F標記HER2納米抗體的研究越來越受到關注?？偟膩碚f，核素標記HER2完整抗體和納米抗體均已呈現出很好的應用前景，將為臨床上在體內檢測HER2表達提供有效的核素顯像探針。