結(jié)直腸腫瘤組織中HIST1H3B的表達變化及意義

李凱迪,王 海,孫伯堯，劉金華,周學穎,岳新顏

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.檢驗科；2.胃腸外科；3.護理部，吉林 長春130033；4.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130021)

結(jié)直腸癌為世界最常見的惡性腫瘤之一。內(nèi)鏡、糞便檢查、腫瘤標志物等都是有效的結(jié)直腸癌篩查手段[1，2]。本次實驗通過探究HIST1H3B在結(jié)直腸癌的表達量及臨床意義，為結(jié)直腸癌診斷探究潛在的新型生物標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗所選取的樣本來源于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院2017年5月至2018年1月經(jīng)消化外科手術(shù)所得共計34例，其采集標本的標準為：經(jīng)病理科檢驗證實為結(jié)直腸癌Dukes B期的腺癌，且術(shù)前未經(jīng)任何治療，排除已發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移的新鮮結(jié)直腸癌組織標本。同時在距離癌組織10 cm且位于癌組織上段處采集癌旁標本。將依據(jù)上述標準所獲得的標本使用生理鹽水徹底沖洗后，將其進行液氮速凍，后于-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1總蛋白的提取與測定

將經(jīng)充分研磨后的癌組織和癌旁組織加入提前配制好的裂解液緩沖液[50 mM Tris，1% NP-40，150 mM NaCl，0.1%SDS，PMSF，0.5 mg/ml Leupeptin (亮抑制肽)]置于冰上震蕩混勻。加入適量的DNA酶和RNA酶去除游離的DNA和RNA后離心。離心機設定為12 000 rpm，4℃，離心時間為15 min。離心后所得上清液即為總蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書要求，測定其在562 nm處的吸光度，將獲取吸光度繪制蛋白濃度標準曲線。

1.2.2蛋白水解多肽混合物的制備

將制備的各組蛋白樣本用5倍體積的50 mmol/LNH4HCO3溶解稀釋。加入適量體積1 mol/L DTT至其終濃度為20 mmol/L，56℃，避光，充分反應1 h，冷卻至室溫后加入1 mol/L的IAM，將其濃度調(diào)定至50 mmol/L，室溫，避光反應0.5 h。在該反應體系中將蛋白∶胰酶以50∶1的比例加入，置于37℃水浴箱中12 h，產(chǎn)物置于-80℃的冰箱中儲存。

1.2.3二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析

使用0.1% FA溶解所得的蛋白多肽樣品，各組樣品取50 μg用于色譜上樣，使用LTQXL離子肼質(zhì)譜儀分析反向色譜洗脫的蛋白多肽樣品，獲得LC/MS質(zhì)譜圖。

1.2.4免疫印跡試驗

使用免疫印跡試驗檢測目標蛋白HIST1H3B在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達量，用于驗證二維色譜與質(zhì)譜的分析結(jié)果。

1.2.5儀器與試劑

NH4HCO3、碘代乙酰胺、DTT、DNA酶、RNA酶、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒、PMSF、HIST1H3B單克隆抗體、β-actin。Agilent 1200高效液相色譜儀、伯樂垂直電泳儀、LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

本次試驗以圖譜數(shù)差異衡量癌組織和癌旁組織中同一的蛋白的豐度。判斷標準如下：一對樣品中蛋白譜圖數(shù)比值≥1且同時滿足該對中蛋白譜圖數(shù)差值≥72者定為差異蛋白。按上述標準，我們檢測到28個差異表達的蛋白，其中包括18個上調(diào)表達蛋白，10個下調(diào)表達蛋白，見表1，目標蛋白HIST1H3B為上調(diào)蛋白，HIST1H3B質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織差異蛋白

表1 差異蛋白名稱

2.2 免疫印跡試驗結(jié)果

對鑒定出HIST1H3B進行免疫印跡試驗，結(jié)果見圖2。HIST1H3B在癌組織中表達量明顯高于其配對的癌旁組織，進一步驗證了LC-MS技術(shù)分析結(jié)果。

圖2 免疫印跡結(jié)果

3 討論

近年來，結(jié)腸癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率雖有所下降，但目前結(jié)直腸癌在年輕人中的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。到2030年，有文獻預測，年齡在20至34歲之間的人罹患結(jié)腸癌和直腸癌的的發(fā)病率均增加90%以上。這些年輕成人結(jié)直腸癌中約有35%與遺傳有關(guān)[3,4]。

HIST1H3B(H3.1)是組蛋白H3家族中的成員之一，它參與構(gòu)成核小體，對于維持染色體正常結(jié)構(gòu)及功能方面有著重要作用，其蛋白家族簇主要由5種蛋白家族H1、H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成[5]。Xie等人通過使用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR證實了組蛋白簇基因家族在乳腺癌患者中高表達。 并且從TCGA數(shù)據(jù)庫中收集的臨床數(shù)據(jù)分析表明組蛋白基因集的較高表達與乳腺癌患者的整體生存率，無復發(fā)生存率和遠處無轉(zhuǎn)移生存率有關(guān)，最終證明組蛋白基因組可以用作預測乳腺癌患者生存的預后因素[6]。有報道表明HIST1H3B在集合管癌(CDC)中上調(diào)表達[7]。Marcussen等人對8名扁桃體鱗狀細胞癌(TSCC)患者在接受放射治療前后進行了連續(xù)的口腔活檢和血細胞檢查并對基因表達分析。發(fā)現(xiàn)放射治療后HIST1H3B表達下調(diào)[8]。Ohshima等人通過采用全外顯子組測序(WES)和基因表達譜(GEP)在內(nèi)的多組學分析。鑒定出HIST1H3B為肺鱗癌的依賴性擴增的驅(qū)動基因。由于基因擴增是腫瘤發(fā)生中的主要事件，鑒定驅(qū)動基因有助于理解癌癥的病因，發(fā)展個體化療法。篩選出的驅(qū)動基因可成為治療靶標[9]。為肺鱗癌患者的治療提供了新的備選方案。Stenman等人通過對嗜鉻細胞瘤(PCC)和腹部副神經(jīng)節(jié)瘤(PGL)的研究發(fā)現(xiàn)HIST1H3B的表達量與嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PPGL)的轉(zhuǎn)移和無復發(fā)生存期均相關(guān)[10]。小兒彌漫性中線神經(jīng)膠質(zhì)瘤(DIPG)是腦干惡性腫瘤其患者中位生存期<1年。其患者80%會發(fā)生H3組蛋白的基因突變[11]，國際和歐洲兒科腫瘤學會DIPG注冊中心合作比較了短期幸存者(STS)和長期幸存者(LTS)的臨床組織分子特征發(fā)現(xiàn)：LTS更有可能攜帶HIST1H3B突變(優(yōu)勢比為1.28； 95%CI為1.1至1.5；P=0.002)[12]。還有研究表明發(fā)生H3-K27M突變的患者中發(fā)生H3.1(HIST1H3B/C)突變的患者的的復發(fā)率明顯低于發(fā)生H3.3(H3F3A)K27M突變患者。且發(fā)生H3-K27M突變的患者對放療不敏感[13]。H3.1-K27M 突變的腫瘤表現(xiàn)出間充質(zhì)/星形膠質(zhì)細胞表型以及缺氧抑或促血管生成的特征，為小兒彌漫性橋腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(DIPG)的患者提供新的治療方向。

目前對HIST1H3B的研究多聚焦于甲基化、磷酸化等多鐘共價修飾方面[14]，對組蛋白本身在癌癥中的作用的研究較少，組蛋白在癌癥發(fā)生發(fā)展中所起到的作用還尚未明確。本研究雖采用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)證明了HIST1H3B在結(jié)直腸癌中的表達量上調(diào)，但HIST1H3B在結(jié)直腸癌中的的分子作用機制還值得科研工作者進一步挖掘。