CD47在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)及意義

朱亞香，王遠(yuǎn)濤，王鈺雄，朱海冬，胡 鈺

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿外二科，吉林 長春130021；2.河南省南陽市第一人民醫(yī)院 泌尿外科，河南 南陽473002；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科，吉林 長春130033)

全世界每年有近43萬患者被診斷為膀胱癌，有超過16.5萬患者因罹患膀胱癌而去世[1]。在我國，膀胱癌已成為發(fā)病率排名第一的泌尿系腫瘤，其發(fā)病率在2014年約為5.71/10萬，死亡率約為2.35/10萬，發(fā)病率、死亡率在全部惡性腫瘤中分別排第13位和第12位[2]。膀胱癌的治療方式主要包括是外科手術(shù)、化療、免疫治療等[3]。近年來，應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)(immune checkpoint)抑制劑治療膀胱癌的免疫療法，已成為泌尿外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4,5]。

CD47，又被稱為整合素相關(guān)蛋白(integrin-associating protein，IAP)，是廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面的免疫球蛋白[6]。在腫瘤免疫中，腫瘤細(xì)胞表面的CD47與巨噬細(xì)胞表面信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein α，SIRPα)結(jié)合后，激活巨噬細(xì)胞內(nèi)部CD47/SIRPα抑制性信號通路，產(chǎn)生“別吃我(don’t eat me)”信號，即抑制巨噬細(xì)胞的吞噬活性和腫瘤相關(guān)抗原呈遞作用，從而產(chǎn)生免疫逃逸，使腫瘤細(xì)胞逃避固有免疫系統(tǒng)的攻擊[7]。最近的多種腫瘤動物模型研究中表明，應(yīng)用CD47阻斷性抗體后，可激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)吞噬活性，從而增強(qiáng)對腫瘤的抑制效應(yīng)[7-10]。但目前有關(guān)CD47在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義相關(guān)報(bào)道較少，本文旨在利用免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemistry,IHC)和Real-Time PCR 技術(shù)探究CD47在膀胱癌中的表達(dá)水平，并探討其與臨床特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院泌尿外二科2016年6月至2018年12月經(jīng)手術(shù)切除的、病例資料完整的62 例膀胱尿路上皮癌組織石蠟切片。另再選取10例膀胱尿路上皮癌組織及其癌旁正常組織的新鮮標(biāo)本，各約 150 mg 左右。患者年齡44-71歲，中位年齡60歲。病理學(xué)分級：56例為高級別，6例為低級別。28例為NMIBC，34例為MIBC。13例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。16例發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)。所選病例均由我院病理科依據(jù) WHO(2004)病理分級標(biāo)準(zhǔn)確定病理分級，以國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)確定臨床分期。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化采用免疫組化MaxVisionTM法檢測膀胱癌組織和正常癌旁組織CD47表達(dá)。陰性對照為使用磷酸鹽緩沖液替代兔抗人 CD47 單克隆抗體(購自 abcam 生物技術(shù)有限公司)處理的膀胱癌組織，陽性對照為人卵巢癌組織。兔抗人 CD47 單克隆抗體稀釋比1:100。染色步驟嚴(yán)格按照MaxVisionTM HRP試劑盒(鼠/兔)(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)說明書操作。

1.3 免疫組化結(jié)果判定免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法由病理科醫(yī)生在顯微鏡下對染色后切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判斷。細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)有棕黃色、黃色顆粒著色即為CD47陽性。通過計(jì)算每張片子4個高倍視野下細(xì)胞著色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞數(shù)百分比級別分?jǐn)?shù)的乘積來表示癌組織CD47的表達(dá)水平。根據(jù)著色強(qiáng)度評分為：無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。細(xì)胞陽性數(shù)百分比評分：無陽性細(xì)胞，0分； <10%陽性率，1分； 10%-30%陽性率，2分；30%-70%陽性率，3分；>70%陽性率，4分。由此CD47表達(dá)水平分為0-12分。CD47表達(dá)水平<6 分表示低表達(dá)，≥6分表示高表達(dá)。

1.4 RNA提取及Real-Time PCR使用Trizol 試劑(購自invitrogen 公司)提取標(biāo)本組織總RNA，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照Trizol 試劑說明書。使用分光光度儀(型號：Thermo scientific Nanodrop 2000C)測定各組織提取的RNA的濃度及純度，OD260/OD280為1.9-2.1表示樣品合格。按M-MLV cDNA 試劑盒(購自賽默飛世爾公司)說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于PCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25℃10 min，42℃60 min，95℃5min，4℃ 10 min。然后以GAPDH為內(nèi)參，合成cDNA為模板，按Power SYBR○R Green試劑盒(購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)說明進(jìn)行擴(kuò)增操作和反應(yīng)體系設(shè)置。引物序列為：GAPDH引物：上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′；CD47引物：上游引物：5′-GGCAATGACGAAGGAGGTTA-3′，下游引物：5′-ATCCGGTGGTATGGATGAGA-3′。Real-Time PCR反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，40個循環(huán)。每個標(biāo)本設(shè)置3份，取平均值。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.5 隨訪通過電話隨訪患者膀胱癌復(fù)發(fā)情況。隨訪截至日期為2019年3月24日，無失訪患者。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化分析CD47在膀胱癌組織中的表達(dá)

CD47陽性表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞質(zhì)，呈黃色或棕黃色，在胞核可見少量表達(dá)。在癌巢組織中，細(xì)胞CD47表達(dá)強(qiáng)度明顯高于周圍組織(圖1)。CD47在62例膀胱癌組織中，高表達(dá)率為43.5%(27/62)。

圖1 CD47在膀胱癌組織中的表達(dá)

2.2 免疫組化分析膀胱癌組織中CD47的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

CD47在MIBC中的高表達(dá)率明顯高于NMIBC(P=0.000)，本次所包含全部28例NMIBC均為CD47低表達(dá)(CD47表達(dá)水平<6 分)。CD47的高表達(dá)率在高級別膀胱癌中明顯高于低級別膀胱癌(P<0.05)。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的CD47高表達(dá)率也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.01)。在隨訪期內(nèi)存在術(shù)后復(fù)發(fā)的患者的CD47高表達(dá)率同樣高于無復(fù)發(fā)者(P<0.01)。CD47表達(dá)情況與患者年齡、性別無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

表1 CD47的表達(dá)與膀胱癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 Real-Time PCR檢測膀胱癌及癌旁組織CD47的表達(dá)

Real-Time PCR結(jié)果表明CD47mRNA在膀胱癌、癌旁組織的相對表達(dá)量為5.20±2.96、1.10±0.64。膀胱癌組織CD47mRNA的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。

圖2 Real-Time PCR檢測膀胱癌及癌旁組織CD47的表達(dá)

3 討論

膀胱癌已成為中國乃至世界發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。在2018年，膀胱癌據(jù)估計(jì)在全世界約有近55萬新發(fā)病例、20萬死亡病例，其中男女比例均為4∶1[3，11]。吸煙和職業(yè)暴露仍然是膀胱癌最主要的危險(xiǎn)因素[2,3]。膀胱癌的治療因腫瘤的分期分級和患者全身狀況而異，主要包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)、根治性膀胱切除術(shù)、放射治療和化療、免疫治療(膀胱內(nèi)灌注卡介苗)等[12]。近年來，隨著對免疫檢查點(diǎn)(如PD-1/ PD-L1、CTLA-4、CD47等)認(rèn)識的深入，免疫檢查點(diǎn)抑制劑正在成為腫瘤治療的新手段。

CD47是一種在多種腫瘤細(xì)胞膜表面過表達(dá)的免疫球蛋白，如急性淋巴細(xì)胞白血病[13]、骨肉瘤[8]、乳腺癌[14]、非小細(xì)胞肺癌、平滑肌肉瘤[15]等。腫瘤細(xì)胞表面的CD47通過與巨噬細(xì)胞表面SIRPα結(jié)合后，可激活巨噬細(xì)胞內(nèi)Src家族激酶使其胞質(zhì)尾端的免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)磷酸化，進(jìn)而使酪氨酸磷酸酶SHP1/2聚集、活化；而這啟動了下游分子的去磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，抑制了包括吞噬活動和細(xì)胞毒性等在內(nèi)的細(xì)胞活性，由此發(fā)揮CD47的“別吃我”作用，使腫瘤細(xì)胞免受巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生免疫逃逸[16-18]。在多項(xiàng)動物腫瘤模型研究中表明，運(yùn)用CD47阻斷性抗體可通過激活巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬活性和對腫瘤抗原的提呈能力，進(jìn)而激活體內(nèi)抗腫瘤免疫，明顯抑制腫瘤生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，延長荷瘤動物生存時間[8,13-15,19]。還有研究表明，CD47在膀胱癌干細(xì)胞表面也呈現(xiàn)高表達(dá)，是膀胱癌干細(xì)胞的標(biāo)記物之一，與膀胱癌干細(xì)胞的“干性”呈正相關(guān)[16,17,20]。

本研究結(jié)果表明，CD47在腫瘤組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織。CD47的高表達(dá)與膀胱癌分期分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)等存在明顯相關(guān)性，提示CD47可能在膀胱癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程中扮演著重要角色。然而，本次研究也存在一定的局限性。第一,所選用病例數(shù)較少，尤其是低級別膀胱癌僅6例，使前述CD47在膀胱癌中的作用缺乏說服力；第二,未檢測淋巴結(jié)中CD47的表達(dá)，特別是發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，因?yàn)檫@可能會對我們認(rèn)識CD47在膀胱癌中的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用提供新的研究方向；第三,由于隨訪時間較短，缺乏CD47與膀胱癌患者術(shù)后的生存時間的關(guān)系。

通過對膀胱癌中CD47/SIRPα信號通路及其它CD47信號通路的深入認(rèn)識，可能使CD47逐漸發(fā)展成為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的免疫檢查點(diǎn)，為后續(xù)膀胱癌患者的個體化治療提供新的理論支撐。