基因敲除去乙?；窼IRT1并靶向結合miR-138-5p誘導前列腺癌細胞PC-3氧化應激和凋亡

張志明,薛 煒*,聶志勇,桑 楠,邱建新,張 波

(1.空軍軍醫大學第二附屬醫院 泌尿外科,陜西 西安710038;2.空軍軍醫大學第二附屬醫院 腫瘤科,陜西 西安710038)

前列腺癌是男性中最常見的癌癥，近年來其發病率和死亡率不斷上升，是男性癌癥相關死亡的第二大原因[1]。根據2012年GLOBOCAN的估計，2012年全世界大約有110萬前列腺癌新發病例，約301.000人死亡[2]。大多數臨床局限性前列腺癌患者接受根治性前列腺切除術或放療。隨后，20%至40%的患者最終出現生化復發，一旦診斷出復發，這些患者就接受雄激素剝奪治療。雖然雄激素剝奪治療可以延長患者的總生存期，降低患者的腫瘤負擔，但最終所有患者都對雄激素剝奪治療產生了耐藥性，出現了去勢性前列腺癌[3]。目前前列腺癌的分子機制尚未完全闡明，因此，研究前列腺癌的分子機制，有助于臨床干預，延緩甚至抑制腫瘤的發生發展。SIRT1是沉默信息調節因子2(silent information regulator 2,Sir2)基因的哺乳動物同源基因，通過DNA修復蛋白P300、P73 NF-kB、腫瘤抑制蛋白FOXO轉錄因子和P53等非組蛋白去乙酰化參與多種細胞過程，包括增殖、凋亡和侵襲，在腫瘤發生中起著重要的作用[4-6]。本研究通過基因敲除去乙?；窼IRT1，探究其靶向結合miR-138b-5p對前列腺癌細胞PC-3氧化應激和凋亡的作用，以期為前列腺癌開發新的治療策略提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM培養液、胎牛血清、胰酶(Invitrogen公司，美國)； MatrigelTM底膜基質(BD公司，美國)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量試劑盒(PIERCE公司，美國)；裂解緩沖液(Beyotime，Shanghai，China)；Caspase-3,Caspase-9,Bcl，Bax抗體 (NEB公司，美國)；HRP標記的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司，美國)；ELX808酶標儀(Bio-Tek公司,美國) ；凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience,San Jose,CA,USA) ；CO2培養箱(Thermo公司，美國)；Transwell小室及人工基底膜(BD公司，美國) ；電熱恒溫水浴箱(上海醫療器械七廠)；高速低溫離心機(Beckman公司，美國)；電泳槽，電轉儀(Bio-Rad公司，美國)；流式細胞儀(Becton-Dickinson,San Jose,CA,USA)；ChemiDoc XRS 凝膠/發光圖像分析儀(Bio-Rad公司，美國)；凝膠成像系統GDS-800 UVP (UVP公司，美國)。

1.2 細胞培養

PC-3細胞株在補充有10%胎牛血清的DMEM培養基中生長。所有細胞均在含有5%CO2的培養箱中37℃培養。細胞匯合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞轉染

將PC-3細胞傳代培養于6孔板中。培養24 h后根據轉染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA)單獨或聯合轉染inhibitor和 shRNA-SIRT1，將細胞分為4組：對照組(Control)，miR抑制劑組(inhibitor)，SIRT1敲除組(shRNA-SIRT1)，miR抑制劑組+SIRT1敲除組(inhibitor+ shRNA-SIRT1)，48 h后對各組進行相應檢測。

1.3.2RT-PCR

使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過超微紫外光分光光度計在260和280 nm處測定吸光度。 按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。 此外，使用Quantifast○RSYBR○RGreenPCR Kit進行PCR，分別在95℃ 15 s 和60℃ 60 s條件下使用ABI 7500將反應激活。用于該反應的SIRT1，miR-138-5p和GAPDH的引物如下：SIRT1：5’-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3’,5’-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAAGA-3’;miR-138-5p:5’-GCTTAAGGCACGCGG-3’,5’-GTGCAGGGTCCGAGG-3’;GAPDH:5’-CATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，5’-GCCTGCTTCA-CCACCTTC-3’。

1.3.3克隆形成實驗

PC-3細胞單獨或聯合轉染shRNA-SIRT1和inhibitor 48 h后，細胞移入6孔板，每孔1000個細胞，孵育10天。在培養過程中每3天更換一次新鮮的完整培養基。細胞菌落洗滌2次，用3 ml甲醇固定15 min，加入1 ml/孔0.1%結晶紫孵育15 min,PBS洗滌3次。記錄細胞克隆數，并在顯微鏡下觀察。

1.3.4Hoechst33258細胞凋亡染色

將細胞用預冷的PBS洗滌2次，每次5 min。細胞在4℃下于 4%多聚甲醛中固定1 h。然后每孔加入1 ml Hoechst33258熒光染料，總共15 min，每次5 min，然后棄去染色液，在暗處用PBS洗滌2次，每次5 min。用熒光顯微鏡觀察細胞并拍照(OLYMPLUSIX73，Japan) 。細胞的核濃縮和分裂被用作細胞凋亡的指標。

1.3.5試劑盒檢測SOD,MDA,LDH的含量

分別采用SOD,MDA,LDH試劑盒測定PC-3細胞上清液 SOD,MDA,LDH的含量。操作步驟嚴格按照大鼠SOD,MDA,LDH試劑盒說明書進行。

1.3.6流式細胞術

采用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒對PC-3細胞凋亡誘導進行分析和測量。用不同濃度的二氫楊梅素或二甲基亞砜作對照，在6孔板中以每孔3×106個細胞的密度培養48 h。然后用過氧化氫處理細胞，在5% CO2、37℃的培養箱中誘導氧化應激。細胞用冷PBS沖洗3次，然后用100 μl結合緩沖液處理。然后用3 μl Annexin V-FITC(BD Bioscience) 和10 μl 碘化丙啶孵育20 min。采用流式細胞儀進行細胞凋亡。

（2）午餐或下午茶吃多了的人。比如午餐吃了自助餐，下午又沒有很大的運動量，到晚餐時間一點都不餓。對于這種情況，可以考慮不吃晚餐。還有下午加餐的朋友，點心、水果、酸奶、堅果、薯片、餅干……樣樣都不少，吃得飽飽的，也可以考慮省去晚餐。

1.3.7免疫印跡法

使用裂解緩沖液裂解細胞樣品。然后，使用BCA蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度。含有20 mg蛋白質的樣品在10%SDS-PAGE中分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(Caspase-3,1∶1000;Caspase-9,1∶1000;Bcl,1∶1000,Bax 1∶1000;) 于4℃封閉過夜，第二天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL,設置曝光參數，檢測目的條帶對應化學發光強弱。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 miR-138-5p和SIRT1在PC-3細胞中的表達量變化

如圖1所示，miR-138-5p mimic轉染PC-3細胞后，與Control組比較，miR-138-5p的表達顯著升高(P<0.05)，SIRT1的表達顯著降低(P<0.05)。inhibitor轉染PC-3細胞后，與Control比較，miR-138-5p的表達顯著降低(P<0.05)，SIRT1的表達顯著升高(P<0.05)。

圖1 miR-138-5p和SIRT1在前列腺癌細胞PC-3中的表達

2.2 基因敲除SIRT1抑制PC-3細胞克隆形成

如圖2所示，單獨或聯合轉染inhibitor，shRNA-SIRT1后，與Control組比較，SIRT1的表達水平顯著降低(P<0.05)。與Control組比較，inhibitor組PC-3細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)。與Control組比較，shRNA-SIRT1組PC-3細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)。與shRNA-SIRT1組比較，inhibitor+ shRNA-SIRT1組PC-3細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)。

圖2 克隆形成實驗檢測細胞的生長能力

2.3 基因敲除SIRT1促進PC-3細胞凋亡

如圖3所示，Control組細胞核具有彌散且較均勻的熒光。inhibitor組細胞核熒光較Control組更均勻。shRNA-SIRT1組細胞核呈不規則形狀或染色質聚合分離，具有密集的顆粒熒光。inhibitor+ shRNA-SIRT1組細胞核致密染色、收縮減少，染色狀態改善。與Control組比較，inhibitor組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；shRNA-SIRT1組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與shRNA-SIRT1組比較，inhibitor+ shRNA-SIRT1組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

圖3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡

2.4 基因敲除SIRT1對SOD，MDA，LDH含量的影響

表1 不同組SOD,MDA,LDH，GSH的含量

2.5 基因敲除SIRT1促進PC-3細胞凋亡

正常PC-3細胞經染色后發出紅色熒光，提示線粒體膜電位完整。如圖4所示，與Control組比較，inhibitor組線粒體膜電位顯著降低 (P<0.05)，shRNA-SIRT1組線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)。與shRNA-SIRT1組比較，inhibitor+shRNA-SIRT1組線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。

圖4 不同組PC-3細胞線粒體膜電位變化

2.6 基因敲除SIRT1抑制線粒體凋亡通路相關蛋白的表達

如圖5所示，與Control組比較，inhibitor組裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；shRNA-SIRT1組裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與shRNA-SIRT1組比較，inhibitor+ shRNA-SIRT1組裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。

圖5 不同組caspase-3,caspase-9,Bcl-2,Bax蛋白表達的變化

3 討論

前列腺癌是男性最常見的癌癥，是癌癥相關死亡的主要原因[7]。大部分患者最終進展為化療耐藥，出現局部復發、遠處轉移、死亡[8]。傳統的化療由于其療效低、副作用大，在正常組織中應用效果有限。因此，急需開發一種新的治療策略來更有效地治療前列腺癌。

miR-138-5p與SIRT1存在靶向關系。已有研究表明SIRT1是miR-138-5p結合的直接靶點[9]。研究發現，SIRT1基因可以通過上調癌基因和上皮-間質-間充質轉化促進腫瘤生長，在前列腺癌中，SIRT1基因的表達水平升高[10]。同樣，Kuzmichev等人通過免疫組織化學分析證明，SIRT1在人前列腺癌小鼠模型的癌組織中過表達，而在正常組織中的表達非常低[11]。SIRT1可通過調控多種miRNA的表達影響癌癥的發展，但尚未有研究報道SIRT1是否能通過靶向調控miR-138-5p的表達影響前列腺癌細胞氧化應激和凋亡。本研究發現miR-138-5p與SIRT1在前列腺癌細胞中的表達呈負調控，用miR-138-5p inhibitor抑制miR-138-5p表達后，SIRT1的表達顯著升高。因此，可進一步研究基因敲除SIRT1靶向結合miR-138-5p對前列腺癌的影響。

癌細胞無限增殖是癌癥發生發展的重要機制。SIRT1過表達與更高水平的前列腺瘤PC-3細胞增殖相關[6]。研究發現基因敲除SIRT1后的胰腺癌細胞增殖明顯受到抑制[12]。相關研究中，基因敲除SIRT1同樣能抑制人宮頸癌細胞的增殖[13]。而有關SIRT1在前列腺癌中的研究，研究證實SIRT1可以促進人類前列腺癌細胞的增殖[14]。Duan等人研究發現miR-34a通過下調SIRT1表達抑制前列腺癌細胞增殖[15]。與前人研究結果一致，本研究發現基因敲除SIRT1明顯降低PC-3細胞克隆形成率，抑制前列腺癌細胞的克隆形成，表明基因敲除SIRT1可抑制PC-3細胞的增殖生長，從而抑制前列腺癌的發展。

LDH是一種可靠的細胞毒性指標，細胞的內源性抗氧化能力與SOD、 MDA有關。研究報道稱前列腺癌患者MDA水平升高，SOD活性降低，LDH活力升高[16,17]。SOD是另一種內源性抗氧化劑，可以中和自由基，保護細胞免受活性氧損傷[18]。 MDA是脂質過氧化途徑的主要終產物，是前列腺癌患者氧化狀態的標志物[19]。因此本研究通過試劑盒測定SOD、 MDA和LDH，與前人研究結果一致，結果發現基因敲除SIRT1提高PC-3細胞SOD活性，降低MDA含量及LDH活力，表明基因敲除SIRT1可能通過改變PC-3細胞的內源性抗氧化能力來誘導氧化應激。

抑制細胞生長和誘導細胞死亡是抑制腫瘤生長的兩種主要手段。在凋亡信號的刺激下，線粒體跨膜電位(ΔΨm)的下降出現在凋亡的特征性細胞核改變之前，而ΔΨm的下降必然引起凋亡。研究發現MiR-204通過靶向SIRT1/p53通路增強阿霉素治療的前列腺癌細胞線粒體凋亡[20]。SIRT1 siRNA能顯著增強多西他賽誘導的裂解的caspase-3表達，并促進22RV1/DR細胞凋亡[6]。同樣，Wang等人研究發現SIRT1的抑制導致Bax表達增加，激活的caspase-3激活以及Bcl-2的表達降低，從而導致缺氧/再灌注誘導的心肌細胞凋亡[9]。與前人研究結果相似，本研究發現基因敲除SIRT1使線粒體膜電位明顯升高，提高裂解的Caspase-3，Caspase-9及Bcl/Bax的蛋白表達水平，表明基因敲除SIRT1能促進前列腺癌細胞的凋亡。

綜上所述，通過基因敲除去乙?；窼IRT1，靶向結合miR-138-5p抑制前列腺癌PC-3細胞的生長，誘導PC-3細胞氧化應激和凋亡，以及促進凋亡相關蛋白的表達，表明基因敲除SIRT1可緩解前列腺癌的發生發展，為將來臨床防治前列腺癌提供實驗依據。