丙泊酚抑制Wnt信號誘導的EMT降低乳腺癌細胞侵襲遷移能力的機制

吳海洋

(棗莊礦業集團棗莊醫院 普外科,山東 棗莊277100)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，我國近些年乳腺癌的發病率呈現上升趨勢，其死亡率居于女性惡性腫瘤首位，嚴重威脅女性的生命健康[1]。目前對乳腺癌的研究主要集中于分子機制方面。丙泊酚(propofol)又稱為異丙酚，是一種短效、快速的靜脈麻醉藥，近些年的多項研究發現，丙泊酚可影響多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移及凋亡，如丙泊酚對人肺癌A549細胞的生長和遷移有明顯的抑制作用，且可促進細胞凋亡，其機制可能與下調AQP1蛋白表達有關[2]。乳腺癌中的研究表明，丙泊酚可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力，并誘導細胞凋亡，但機制尚未明確[3，4]。經典Wnt信號通路，也稱為Wnt/β-catenin信號通路，在腫瘤發生、細胞發育等過程中被激活，進而促進腫瘤發生發展[5,6]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號致癌的關鍵是β-catenin在細胞質/核內積累，β-catenin的異常表達與腫瘤發生相關，cyclinDl和c-myc是Wnt信號非常重要的靶基因[7]。研究表明，EphA2siRNA能夠逆轉Wnt信號激活劑LiCl誘導的胃癌AGS細胞EMT，降低發生了上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的胃癌AGS細胞的侵襲力[8]；FL118抑制乳腺癌細胞EMT的機制與Wnt通路有關[9]。本研究試圖證實丙泊酚是否可通過抑制Wnt信號誘導的EMT降低乳腺癌細胞侵襲及遷移能力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM培養基、FBS、青鏈霉素均購自美國Gibco；抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗體均購自美國CST；MTT、DKK-1人重組蛋白和LiCl購自美國Sigma；Transwell小室試劑盒購自美國Corning；Matrigel基質膠購自美國BD。酶標儀購自美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自美國ATCC。細胞在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，于5% CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度條件下常規傳代培養。實驗為生長至對數期的細胞。

1.2.2丙泊酚對Wnt信號及EMT相關蛋白表達的影響 收集40 μmol/L的丙泊酚處理48 h的MDA-MB-231細胞，加適量細胞裂解液于冰上反應30 min，離心，收集上清，BCA法測定上清中蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加5× SDS-PAGE上樣緩沖液，于沸水中煮沸變性5 min，取變性蛋白，每孔道上樣等量(30 μg)，經10% SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白依次經PVDF轉膜、5%脫脂奶粉封閉后，加皆為1∶500稀釋的抗β-catenin、cyclinDl、c-myc、E-cadherin、vimentin和N-cadherin抗體，4 ℃搖床孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記的 II抗，室溫孵育2 h，洗滌，ECL顯示，曝光，Quantityone軟件測定灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達量。

1.2.3Wnt信號抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細胞活力的影響 以5×103/孔的細胞濃度接種生長至對數期的MDA-MB-231細胞于96孔板，每孔100 μl，常規培養24 h后，使用100 ng/mL的DKK-1及20 mmol/L的LiCl處理MDA-MB-231細胞，細胞無特殊處理的為空白對照組，每組設置5個復孔，處理48 h后加MTT，每孔20 μl，繼續培養4 h，吸去上清液，加DMSO，每孔150 μl，震蕩混勻10 min，酶標儀測定490 nm處的吸光度值(A值)。

1.2.4DKK-1或LiCl對MDA-MB-231細胞EMT相關蛋白表達的影響 收集100 ng/mL的LiCl及20 mmol/L的LiCl處理48 h的MDA-MB-231細胞，參照方法1.2.2檢測E-cadherin、vimentin和N-cadherin的蛋白表達。

1.2.5丙泊酚激活或抑制Wnt信號對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的影響 MDA-MB-231細胞分為對照組(細胞不經特殊處理)、丙泊酚組(40 μmol/L的丙泊酚處理細胞48 h)、丙泊酚+DKK-1組(40 μmol/L的丙泊酚及100 ng/mL的LiCl處理細胞48 h)和丙泊酚+LiCl組(40 μmol/L的丙泊酚及20 mmol/L的LiCl處理細胞48 h)。采用transwell小室檢測。Transwell小室預先鋪Mateigel基質膠，Transwell小室的上室中加按照上述分組處理后制備的細胞懸液(100 μl)，下室中加入500 μl含10% FBS的培養液，于5% CO2、37 ℃恒溫常規孵育24 h，棉簽輕拭去上室底部細胞，4%多聚甲醛及0.1%結晶紫染色后，隨機計數5個高倍視野下(×200)侵襲至濾膜下表面的細胞數，取均值。檢測細胞遷移能力實驗的分組處理及實驗方法同上，區別在于未鋪Mateigel基質膠。

1.3 統計學方法

所有實驗數據采用SPSS21.0軟件進行分析。計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組數據采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚對MDA-MB-231細胞Wnt信號通路相關蛋白表達的影響

如圖1所示，丙泊酚處理后的MDA-MB-231細胞Wnt信號通路相關蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表達均明顯降低，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 丙泊酚對MDA-MB-231細胞Wnt信號通路相關蛋白β-catenin、cyclinDl和c-myc蛋白表達的影響

2.2 丙泊酚對MDA-MB-231細胞EMT相關蛋白表達的影響

如圖2所示，丙泊酚可上調與EMT相關的E-cadherin蛋白表達，下調vimentin和N-cadherin蛋白表達，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 丙泊酚對MDA-MB-231細胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響

2.3 Wnt信號抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細胞活力的影響

如圖3所示，Wnt信號抑制劑DKK-1可抑制MDA-MB-231細胞的活力，而其激活劑LiCl可增加細胞活力，與對照組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖3 Wnt信號抑制劑DKK-1及激活劑LiCl對MDA-MB-231細胞活力的影響

2.4 DKK-1對MDA-MB-231細胞E-cadherin、vimentin和N-cadherin蛋白表達的影響

如圖4所示，DKK-1可上調E-cadherin蛋白表達，下調vimentin和N-cadherin蛋白表達，與對照組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.5 LiCl對MDA-MB-231細胞E-cadherin、Vim-entin和N-cadherin蛋白表達的影響

如圖5所示，LiCl可下調E-cadherin蛋白的表達，上調vimentin和N-cadherin蛋白的表達，與對照組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.6 DKK-1或LiCl增加或降低丙泊酚對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的抑制作用

Transwell小室檢測的各組細胞侵襲及遷移能力檢測結果如圖6所示，丙泊酚組細胞侵襲及遷移數均顯著低于對照組(P<0.05)，而丙泊酚+DKK-1組細胞侵襲及遷移數顯著低于丙泊酚組，丙泊酚+LiCl組細胞侵襲及遷移數顯著高于丙泊酚組(P<0.05)。

圖6 Transwell小室實驗檢測各組細胞的侵襲及遷移能力的變化

3 討論

腫瘤侵襲及轉移過程較為復雜，受多種蛋白和基因的調控，目前對多數實體腫瘤的主要治療手段是手術切除，但難以避免術后的復發及轉移[10,11]。作為腫瘤切除手術常用的靜脈麻醉藥，丙泊酚對腫瘤的影響受到廣泛關注。有研究表明，丙泊酚可通過抑制MMP-2和MMP-9表達降低肺癌細胞的侵襲和遷移能力[12]；可通過減少Slug表達抑制卵巢癌細胞侵襲及遷移能力[13]；可通過下調microRNA-221抑制胃癌細胞增殖和侵襲能力[14]。以上研究表明，丙泊酚可通過不同途徑抑制不同腫瘤細胞侵襲及遷移能力。

上皮-間質轉化(EMT)是上皮細胞在特定的生理病理情況下向間質樣細胞轉化的現象。其生物學過程非常復雜，涉及多個步驟及多個基因，與腫瘤侵襲轉移密切相關[15,16]。對大多數腫瘤來說，在其向惡性發展過程中經常伴隨有細胞向上皮分化功能的喪失，進而朝間質樣表型轉化，而有EMT發生更易促進細胞的侵襲及遷移[17,18]，因此，EMT在惡性腫瘤侵襲和遷移中的作用已成為目前的一個研究熱點。研究發現，Wnt、Notch、MAPK等多種信號轉導途徑參與腫瘤細胞EMT過程[19,20]。Wnt信號是細胞內一條重要的信號途徑，參與細胞增殖、凋亡、分化、侵襲遷移等生物學行為的調節，在多種腫瘤中Wnt信號被異常激活，Wnt信號激活后可使β-catenin在胞質中大量聚集，進而轉移至細胞核，最終激活下游cyclinDl和c-myc等的過度表達，影響細胞的生物學特性[21,22]。有研究顯示，SHP2E76K和SHP2WT可通過Wnt/β-catenin信號促進結直腸癌細胞遷移和誘導EMT[23]。Raptor能通過Wnt3a/β-catenin信號通路促進EMT的發生，進而影響乳腺癌細胞的侵襲與轉移[24]。

E-cadherin的丟失或減少是EMT最重要的標志，細胞中許多轉錄因子和生長因子如vimentin、N-cadherin、Twist1等的過表達也可誘導EMT，進而提高腫瘤的侵襲及遷移能力[25]。丙泊酚可通過抑制Wnt/β-catenin通路，下調轉移瘤組織中E-cadherin和β-catenin的表達，從而抑制MADB106細胞肺轉移[26]。丙泊酚可上調E-cadherin，下調vimentin、N-cadherin、p-p38等表達和降低HDACs活性，進而抑制胃癌細胞侵襲遷移及EMT過程[27]。

本研究結果顯示，丙泊酚可抑制Wnt信號β-catenin、cyclinDl和c-myc的蛋白表達。上調E-cadherin表達，下調vimentin和N-cadherin表達。提示丙泊酚可抑制Wnt信號及EMT過程。Wnt信號抑制劑DKK-1及激活劑LiCl處理乳腺癌細胞后，發現DKK-1可上調E-cadherin表達，下調vimentin和N-cadherin表達，而LiCl可下調E-cadherin表達，上調調vimentin和N-cadherin表達，這提示抑制Wnt信號可抑制EMT過程，激活Wnt信號可促進EMT過程。細胞侵襲及遷移檢測結果發現，丙泊酚可抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力，聯合DKK-1對細胞侵襲遷移能力抑制更明顯，而聯合LiCl可增強細胞的侵襲及遷移能力。提示丙泊酚可通過抑制Wnt信號誘導的EMT降低乳腺癌細胞侵襲遷移能力。

綜上所述，丙泊酚可抑制Wnt信號和EMT過程，抑制Wnt信號可減弱EMT，而激活Wnt信號可增加EMT，丙泊酚可通過抑制Wnt信號誘導的EMT降低乳腺癌細胞侵襲遷移能力。該研究可能為丙泊酚對乳腺癌細胞影響的機制研究提供了一定的理論依據。