吉非替尼對兔膝骨性關節炎的病理特征及相關因子的影響

謝大偉，張來鑫，李青松，王 靜，王 彤*

(1.秦皇島市中醫醫院 手足外科,河北 秦皇島066000；2.青龍縣醫院 婦產科,河北 青龍066500)

骨性關節炎(osteoarthritis,OA)又稱退行性關節炎，是目前最常見的肌肉骨路系統疾病之一[1]?，F階段，我國OA人數約為3 600萬，隨著我國人口的老齡化，OA患者的數量逐年增加[2]。使用非甾體類藥物可以治療OA，但非甾體類藥物僅能改善患者的疼痛癥狀，不能抑制軟骨破壞的病理過程，同時對患者的運動功能的改善效果也不佳[3]。使用小分子藥物抑制OA軟骨的降解并促進軟骨基質的合成，成為目前治療OA的有效途徑之一[4]。因此現階段研究可以抑制OA軟骨的降解并促進軟骨基質的合成的藥物具有重要的意義。吉非替尼是一種EGFR受體的抑制劑，可以通過抑制EGFR受體的活性從而提高軟骨的自噬水平達到延緩OA的進展[5]。同時吉非替尼也可以抑制OA中相關炎癥因子的表達，促進軟骨基質的合成[6]。本文旨在研究吉非替尼對兔膝OA的病理特征及相關自噬和炎癥因子影響，以期了解吉非替尼對兔OA的作用機理，從而為OA的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性SPF級新西蘭大白兔60只，體重(2.5±0.3)kg；購自武漢市萬千佳禾實驗動物養殖有限公司。所有大白兔均在本院動物中心FPS級實驗室飼養，飼養溫度20-25℃，相對濕度50%-65%，該實驗經過動物倫理委員會批準同意。

1.2 藥物與試劑

吉非替尼(易瑞沙；國藥準字：J20180014)生產廠家：日本Kagamiishi Plant,Nipro Pharma Corporation；白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒購自上海紀寧酶聯科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購自上?；鈱崢I有限公司；白細胞介素-6 (interleukin- 6,IL-6)試劑盒購自美國Sigma 公司；Bcl-2、Bax抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；Caspase-3抗體購自武漢華聯科有限公司；p62抗體購自Sino Biolocgical公司；LC3試劑盒子購自江萊生物有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司。

1.3 儀器

BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統有限公司；TGL-16M低溫離心機購自濟南來寶醫療器械有限公司； SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1分組及建立模型

將60只大白兔適應性喂養 1 周，隨機選15只為空白對照組，其余45只大白兔采用制備成OA模型，制作方法及判斷模型是否成功參考陳海霞等[7]研究。具體操作如下：按照40 mg/kg的量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，使用碘伏消毒沿髕韌帶內側切開約大小約為0.5 cm的切口，切斷大白兔膝關節前交叉韌帶，立即消毒，縫合?？瞻讓φ战M組僅暴露膝關節不切斷大白兔膝關節前交叉翻帶，消毒縫合。

1.4.2藥物干預

低劑量吉非替尼組造模成功1周后，使用吉非替尼0.4 mg/kg d-1灌胃處理；高劑量吉非替尼組模成功1周后，使用吉非替尼0.8 mg/kg d-1灌胃處理；空白對照組和模型組與低劑量吉非替尼組和高劑量吉非替尼組同時使用等量的生理鹽水灌胃處理，各組均處理6周。

1.4.3檢測項目

①免疫熒光檢測LC3含量

取大白兔股骨內髁所有關節軟骨，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成單層細胞后，按照免疫熒光檢試劑盒說明操作檢測LC3含量。

②炎癥因子水平檢測

從頸總動脈插管接取3 ml 大白兔血液，嚴格按照IL-1β、IL-6和TNF-α試劑盒上的操作方法，檢測其含量水平。

③流式細胞儀檢測大白兔軟骨細胞凋亡

取大白兔股骨內所有髁關節軟骨，使用剪刀剪碎，使用胰蛋白酶消化成單層細胞后，使用恒溫離心機保持4℃，離心 5 min 收集細胞；收集細胞后加入 100 μl Binding Buffer 重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式細胞儀檢測大白兔軟骨細胞凋亡情況。

④Western blot 檢測大白兔膝骨關節Beclin1、LC3、p62、MMP-13及Adamts5蛋白表達水平

使用機械和裂解液提取大白兔軟骨組織蛋白，使用超聲破碎細胞，使用離心機離心3 000 r/min離心15 min后，加入200 μl的Loading Buffer 緩沖液，100℃煮沸 10 min；使用BCA法測定蛋白濃度后，使用電泳法提取蛋白提取總蛋白，半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的Beclin1小鼠單克隆IgG、LC3小鼠單克隆IgG、p62MMP-13小鼠單克隆IgG等一抗和HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG二抗，孵育2 h，以β-actin為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

⑤HE染色觀察大白兔軟骨形態

HE染色觀察大白兔軟骨形態，取股骨內髁關節軟骨修成1 mm×1 mm×1 mm的全軟骨層，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脫水、蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化、沖洗、伊紅染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，最后中性樹膠封片即可。在10×40的倍鏡觀察大白兔軟骨形態。

1.4.4統計學方法

2 結果

2.1 各組大白兔自噬情況檢測結果

由圖1(A、B)可以看出，相比空白對照組，模型組Beclin1、LC3、p62蛋白表達情況無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，低劑量吉非替尼組Beclin1、LC3蛋白表達水平顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；相比低劑量吉非替尼組，高劑量吉非替尼組Beclin1、LC3蛋白表達水平顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 各組大白兔自噬情況檢測結果

2.2 各組大白兔體內炎癥因子檢測結果

由圖2可以看出，相比空白對照組，模型組IL-1β、Il-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量吉非替尼組IL-1β、Il-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；相比低劑量吉非替尼組，高劑量吉非替尼組IL-1β、Il-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組大白兔體內炎癥因子檢測結果

2.3 各組大白兔軟骨降解酶MMP-13及Adamts5表達

由圖3可以看出，相比空白對照組，模型組MMP-13及Adamts5蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組，低劑量吉非替尼組MMP-13及Adamts5蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比低劑量吉非替尼組，高劑量吉非替尼組MMP-13及Adamts5蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 各組大白兔軟骨降解酶MMP-13及Adamts5表達

2.4 各組大白兔軟骨形態觀察

由圖4可以看出，相比空白對照組，模型組軟骨被破壞程度顯著升高，同時軟骨組織出現裂縫；相比模型組，使用吉非替尼處理后大白兔軟骨結構較完整，軟骨細胞形態改變較小且病理程度上的改變明顯較模型組輕。

圖4 各組大白兔軟骨形態觀察

3 討論

自噬可以在一定程度上保護膝關節軟骨細胞，在正常膝關節軟骨細胞中自噬可以持續激活并保證膝關節軟骨細胞在低血供時的能量供應[8]。同時正常程度的自噬可以清除細胞內損傷蛋白質和失去功能的細胞并維持細胞的正常功能和活力[9]。P62 是一種泛素結合蛋白，這種蛋白與蛋白質的泛素化密切相關。P62可以參與細胞信號轉導調控及自噬過程[10]。陳飛等[11]研究表明：P62 是反映自噬活性的標記蛋白之一，p62含量越高細胞內自噬水平較低，其含量間接反映自噬小體清除水平。Beclin 1則是PI3K 復合物的亞基同時是自噬體形成所必須的蛋白。本研究發現，相比模型組，低劑量吉非替尼組Beclin1、LC3蛋白表達水平顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低；說明使用吉非替尼處理后大白兔的自噬能力顯著增強，這可能是因為在大白兔膝軟骨中P62 與泛素化的蛋白質結合，再與定位于自噬小體內膜上的 LC3 II 蛋白形成復合物，被自噬溶酶體內降解。使得大白兔軟骨中的P62蛋白降低，同時相比低劑量吉非替尼組，高劑量吉非替尼組Beclin1、LC3蛋白表達水平顯著升高，p62蛋白表達水平顯著降低，說明在一定濃度范圍內吉非替尼可以增強大白兔膝骨的自噬能力且呈濃度依賴性。俞晨等[12]研究表明：降低關節炎成纖維樣滑膜細胞中自噬蛋白LC3I/II、beclin-1的表達可以有效抑制其凋亡，于本研究得出的結論相類似。

臨床和動物實驗均證明炎癥過程在OA軟骨降解中起關鍵作用[13]。炎癥因子包括促炎癥因子和抗炎癥因子兩種，促炎癥因子水平升高，則體內炎癥因子水平降低表明體內炎癥反應加??；相反抗炎癥因子升高，體內炎癥因子受到抑制，則炎癥反應減弱[14]。目前研究較多的促炎性細胞因子包括：TNF-α、IL-1β，IL-6 和IL-8 等[15]；抗炎性細胞因子則包括：IL-4，IL-10等[16]。本研究主要探究了IL-1β、Il-6、TNF-α三種炎性因子，發現相比模型組，低劑量吉非替尼組IL-1β、Il-6、TNF-α水平顯著降低，且高劑量吉非替尼組IL-1β、Il-6、TNF-α水平顯著低于低劑量吉非替尼組。說明吉非替尼可以有效降低大白兔體內的炎癥反應。這可能是因為吉非替尼提可以通過抑制免疫分子的傳導，實現抑制炎癥因子的分泌，達到抑制炎癥的作用，且本實驗發現，提高吉非替尼的使用劑量可以有效增強對炎癥因子的抑制。聶廣輝[17]研究表明：吉非替尼可以減少TNF-α、IL-1、IL-5、IL-6等炎性細胞因子的表達，與本研究得出的結論相類似。

解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5是自噬的關鍵基因之一，其高表達說明自噬能力較強。MMP-13是基質金屬蛋白酶-13，在炎癥性和退行性關節疾病的發生發展過程中通過抑制降解關節軟骨外基質實現保護的作用[18]。本研究發現相比模型組，使用吉非替尼處理后大白兔軟骨組織中Adamts5和 MMP-13表達水平顯著降低。這可能是因為自噬關鍵基因Adamts5是膜受體EGFR的下游基因，而吉非替尼是一種EGFR受體抑制劑，通過阻滯EGFR受體的實現抑制Adamts5蛋白的表達實現保護大白兔的膝骨的作用。吉非替尼可以促進膠原的合成并且抑制MMP-13的表達來實現抑制關節軟骨外基質的降解來保護大白兔的膝骨。祁雷等[19]研究表明：降低骨關節炎軟骨組織中MMP-13和ADAMTS-5的表達可使得骨關節炎病情的到緩解相一致。

綜上所述，吉非替尼可緩解膝骨性關節炎并降低炎癥關因子，且在一定劑量范圍內呈劑量依賴性，其作用機制與提高自噬能力、降低炎癥反應相關。細胞的自噬涉及到的相關蛋白和信號通路較多，在后續的實驗中將進一步探究吉非替尼治療OA涉及到的信號通路。