GC-MS/MS 法同時分析煙葉中42 種有機酸

王 冰，余晶晶，蔡君蘭，郭吉兆，鄒西梅，李小蘭，崔華鵬，張曉兵，劉紹峰，謝順萍，吳晶晶*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 廣西中煙工業有限責任公司，南寧市西鄉塘區北湖南路28 號 530001

3. 貴州中煙工業有限責任公司，貴陽市小河區開發大道96 號 550000

煙草中有機酸可分為脂肪酸和非脂肪酸。各短鏈及長鏈脂肪酸由于其揮發、半揮發性及其特征香氣和本身的酸性，對卷煙香氣質量如卷煙的勁頭、刺激性等產生顯著影響［1-3］。而非脂肪類有機酸（羥基酸、氧代酸、芳香酸等），也具有特征的香氣和吃味；例如，乳酸具有奶香味，能使煙氣更柔順醇和；4-氧代壬酸具有刺激的、辛辣的味道，能增加煙氣豐滿度；苯甲酸表現為弱的、淡的醇和香味；肉桂酸具有和順的、醇和的，微弱的香脂香味等［4-5］。因此，研究煙葉中有機酸的種類和含量對了解煙草的感官品質和改進卷煙配方具有重要的價值和意義。目前國內外關于有機酸定性定量的方法較多，主要有離子色譜法［6-8］、毛細管電泳法［9-11］、液相色譜法［12-13］、氣相色譜法等［14-17］。離子色譜、毛細管電泳、液相色譜法基本用于含量高的多元酸和多羥基酸的分析。在氣相色譜法中，由于前處理中應用了甲酯化、硅烷化等衍生方法，基本能分析揮發性酸及半揮發性酸，但是，對于煙葉中含量低的揮發性脂肪酸（如：異丁酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸等），高級脂肪酸（十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸）及其他非脂肪有機酸（如4-氧代壬酸、肉桂酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸等），由于受儀器靈敏度的限制及雜質干擾影響，均難以準確定量。近年來，串聯質譜由于其更高的選擇性和靈敏度被用于農藥［18］、代謝物［19］等分析研究工作中，2014 年，Lin 等［20］應用GC-MS/MS 對煙葉中的有機酸進行了分析,由于樣品沒有經過衍生化，目標物僅包含個別揮發酸及部分高級脂肪酸，且峰形拖尾。本研究中基于GC-MS/MS 技術，建立了硅烷化衍生同時檢測煙葉中42 種有機酸的方法，旨在為煙葉有機酸高通量分析提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

選擇4 種類型煙葉（烤煙、白肋煙、香料煙、曬紅煙）樣品。其中烤煙樣本又包括清香型、中間香型、濃香型樣品。實驗樣品共計16 個，其信息見表1。

甲酸、乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、巴豆酸、異戊酸、戊酸、異戊烯酸、惕各酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、十七酸、亞油酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸、十九酸、二十酸（純度均＞98.0%，加拿大TRC 公司）；3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸、壬酸、反-2-己烯酸、十一酸、十二酸、十四酸、12-甲基十四烷酸、十六酸（純度均＞98.0%，北京百靈威公司）；乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羥基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、間甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羥基苯甲酸、肉桂酸（＞98.0%，美國Sigma Aldrich 公司）；二氯甲烷（色譜純，美國Acros Organics 公司）；磷酸（分析純，天津科密歐試劑開發中心）；N,O-雙（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，美國 Sigma Aldrich 公司）。

TRACE 1310／TSQ QUANTUM XLS 氣 相 色譜/串聯質譜聯用儀（GC-MS/MS，美國Thermo Scientific 公司）；CP224S 電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；Advanced Multi-Tube Vortexer數顯型渦旋儀（美國Talboys 公司）；702 SM Titrino pH 計（瑞士Metrohm 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

分別稱取42 種一定量的有機酸標品于10 mL容量瓶中，配制單標母液。取一定量的各單標母液于10 mL 容量瓶中，配制混標母液。梯度取混標母液于7 個10 mL 容量瓶中，配制7 級混標，制作標準曲線。采用反-2-己烯酸為內標，內標質量濃度為0.5 μg/mL。

表1 樣品信息Tab.1 Leaf sample information

1.2.2 樣品處理及分析

pH 調節溶液配制：將 60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 90 mL 水中，再加入 9.5 g 85% H3PO4配成泡發液。

萃取及衍生化：稱取煙粉2 g，加入2 mL pH調節溶液，細玻棒攪拌后，用1 mL pH 調節溶液淋洗玻棒，使煙粉充分浸潤。加入75 μ g/mL 的反-2-己烯酸內標溶液100 μL，泡發30 min，此時體系pH 約為2.5。加入15 mL 二氯甲烷萃取液，于2 500 r/min 下渦旋20 min，靜置，過有機相濾膜。取濾液1 mL，加入BSTFA 衍生化試劑150 μL，擰緊密封蓋后搖勻，于60 ℃下衍生40 min，樣品冷卻至室溫，進GC-MS/MS 分析。分析條件如下：

色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm id×0.25 μm df）毛細管柱；進樣口溫度：280 ℃；載氣：He（＞99.999%），流速1.0 mL/min；程序升溫：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升至 280 ℃并保持20 min；進樣量：1.0 μL，分流比10∶1；傳輸線溫度：280 ℃；電離（EI）能量：70 eV；離子源溫度：300 ℃；四極桿溫度：180 ℃；電子倍增器電壓：1.491 kV；掃描方式：SIM 和SCAN；質量掃描范圍：50～400 amu；監測方式：多反應監測（MRM）。42 種化合物質譜采集參數見表2。

1.2.3 數據處理

采用標樣對照，NIST98 譜庫檢索方法定性，內標工作曲線法定量。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 質譜條件的確定

通過對500 ng/mL 混標溶液一級全掃描，選取信號響應較高且基質無干擾的特征離子為母離子。以母離子為前體離子，進行產物離子掃描，選取信號響應高，基質無干擾的離子為子離子。每種化合物選取兩對離子對，分別為定性定量離子對，依次加以 5、10、15、20、25 和 30 eV 碰撞能，選取離子對響應最高的碰撞能。優化好的定性定量離子對及相應的碰撞能量如表2 所示。通過色譜分離及串聯質譜的進一步降噪，提高了方法的靈敏度及選擇性，實現了42 種有機酸的同時準確定量。代表性有機酸在串聯質譜與一級質譜上的響應比較如圖1 所示：在一級質譜上無法準確定量的8 種化合物（異丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸、丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）在串聯質譜上均能準確定量。

2.1.2 前處理條件的確定

選取代表性酸性成分甲酸、乙酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、十六酸、亞油酸、乳酸、苯甲酸進行前處理條件的優化。分別對泡發煙葉pH（5.4、4.4、3.9、3.4、2.9、2.5、2.0）、渦旋萃取時間（5、10、15、20、25 min）、衍生溫度（室溫、60 ℃）、衍生時間（10、20、30、40、50 min）、衍生化試劑用量（50、100、150、200、250、300 μL）條件進行了考察。確定將泡發煙葉體系pH 調整至2.5，萃取20 min 后，取 1 mL 上清液加入 150 μL BSTFA 于 60 ℃衍生40 min 為前處理條件。按每組實驗數據最大值歸一化結果作圖，結果見圖2。

表2 42 種有機酸保留時間及質譜參數Tab.2 RT and MS parameters for 42 organic acids

圖1 代表性化合物串聯質譜與一級質譜離子流圖比較Fig.1 Comparison of ion current diagrams by MS-MS and MS of representative compounds

圖2 前處理條件優化結果Fig.2 Optimized pretreatment conditions

2.2 方法評價

2.2.1 標準曲線、檢出限及定量限

以各目標物與內標物的離子對響應面積比為縱坐標，濃度（ng/mL）為橫坐標作圖，得到標準工作曲線。分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果（表3）顯示，目標物的線性關系良好，可以滿足定量分析要求。

2.2.2 方法精密度及回收率

選取典型烤煙樣品，一天內進行5 平行實驗以考察方法日內精密度，對所選樣品連續5 天進行實驗以考察方法日間精密度。以實際樣品含量為參考，根據所對應的酸在煙末中含量的0.5、1、2 倍進行低、中、高加標回收率實驗。結果表明：各目標酸性成分平均回收率為76%～110%，日內、日間精密度（除3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、癸酸外）均小于10%。

2.3 樣品分析

采用所建立的方法對12 個烤煙C3F 樣品（清香型烤煙4 個，中間香型烤煙4 個，濃香型烤煙4個），2 個白肋煙樣品，1 個香料煙和1 個曬紅煙樣品進行測定，具體樣品信息見表1。

2.3.1 3 種香型烤煙之間酸性成分差異分析

對清香型、中間香、濃香型烤煙的測定結果分別求平均值后進行比較分析，篩選出不同香型間差異性酸性成分21 種，對每種目標物進行最大值歸一化作圖。結果（表4、圖3）顯示：①3 種香型烤煙中差異性大的酸性成分主要是C5～C8碳鏈脂肪酸（0.1～2 μg/g）、芳香酸（2～6 μg/g）、羥基酸（1～7μg/g）及氧代酸（0.05～0.8 μg/g），高級脂肪酸僅需關注十四酸（15～22 μg/g）和亞麻酸（300～500 μg/g）。②C5～C8中碳鏈直鏈脂肪酸（戊酸、己酸、庚酸、辛酸）、芳香酸（苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、2-羥基苯甲酸）及十四酸、惕各酸在濃香型煙葉中含量顯著高于清香型及中間香型煙葉；4-甲基戊酸含量顯著低于清香型及中間香型煙葉。③異戊酸、3-甲基戊酸，短鏈羥基酸（3-羥基丙酸、乳酸）及亞麻酸、2-呋喃甲酸在中間香型烤煙中含量顯著高于濃香型和清香型。④清香型烤煙中4-氧代壬酸、2-甲氧基苯甲酸含量最高。

2.3.2 不同類型煙葉之間酸性成分差異分析

比較分析烤煙（取均值）、白肋煙（取均值）、香料煙、曬紅煙的測定結果，篩選出不同類型煙葉間差異性酸性成分34 種，對每種化合物進行最大值歸一化作圖。結果（表5、圖4）顯示：①大多數低級、高級脂肪酸及羥基酸、氧代酸在香料煙中含量最高，在烤煙中含量最低，白肋煙及曬紅煙中的含量居中。②代表性芳香酸如苯甲酸、苯乙酸及異戊酸和巴豆酸在白肋煙中含量最高，遠高于在其他3 種類型煙葉中的含量。③以往未檢出的2-辛烯酸、2-甲氧基苯甲酸在曬紅煙中含量最高。

表3 42 種目標物的線性方程、回收率、RSD（n=5）和檢出限Tab.3 Linear equations, spiked recoveries, RSD（n=5）and limits of detection of 42 organic acids

表4 3 種香型烤煙中21 種酸性成分含量Tab.4 Contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types （μg·g-1）

圖3 3 種香型烤煙中21 種有機酸含量雷達圖Fig.3 Radar diagram displaying the contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types

表5 4 種類型煙葉中34 種酸性成分含量Tab.5 Contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco （μg·g-1）

圖4 4 種類型煙葉中34 種有機酸含量雷達圖Fig.4 Radar diagram displaying the contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco

3 結論

建立了基于硅烷化-GC-MS/MS 技術的煙葉中有機酸分析方法，本方法可分析的目標化合物多，涵蓋了C1～C20脂肪酸、羥基酸、芳香酸、氧代酸等，本研究中共定量分析了煙草中的42 種有機酸。本方法精密度好，準確度高，操作簡單。與一級質譜檢測方法相比，本方法靈敏度與選擇性大幅提高，對于在一級質譜上檢測不到的目標物（如：異丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸）、有干擾不能進行準確定量的目標物（如：丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）及含量較低的酸性成分（如：2-辛烯酸、十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸等），均可準確定量。本方法可用于研究不同類型及同一類型不同香型煙葉中的有機酸。