玉米骨干自交系京2416雜種優勢及遺傳重組解析

趙久然，李春輝，宋偉，劉新香，王元東，張如養，王繼東，孫軒，王夏青

（北京市農林科學院玉米研究中心/玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，北京100097）

0 引言

【研究意義】骨干自交系的形成和有效利用對作物遺傳育種進程具有重要的推動作用[1]。選自地方品種塘四平頭的骨干自交系黃早四[2]，開創了中國緊湊型玉米育種新局面，利用黃早四衍生出眾多優良自交系，包括昌7-2、Lx9801、京24、京2416等[3-5]。其中，優良自交系京2416是在中國玉米籽粒機收重大產業需求背景下育成的，具有耐密植抗倒伏、抗病抗逆性強、適宜區域廣、早熟脫水快、自身產量及配合力高等多方面優點，已成為當前中國廣泛利用的重要骨干自交系之一。利用京 2416組配選育出京農科728、京農科 828、NK718、MC121、MC812等 21個優良玉米新品種（電子附表1），具有高產優質、多抗廣適、易制種等綜合優點，已在生產上累計推廣300萬hm2以上。其中，京農科728突破了黃淮海夏玉米籽粒機收技術瓶頸，成為中國首批通過國家審定的機收籽粒品種，引領夏玉米機收籽粒育種方向[6-8]。【前人研究進展】京2416是通過優良黃改群自交系京24和5237遺傳重組形成的。重組是基因組進化的重要驅動力之一，可以增強物種的遺傳多樣性。通過重組實現多態位點重新排列，從而有機會獲得新的、更優良等位基因組合，對作物育種具有重大貢獻[9]。高通量芯片和測序技術的發展，使重現骨干親本形成過程中的重組事件成為可能[9-12]。近年來，對玉米骨干自交系遺傳重組進行了大量的研究。LAI等[10]對6個玉米骨干自交系（沈5003、掖478、鄭58、昌7-2、178和Mo17）進行了全基因組測序，通過同源傳遞片段（identity-by-descent，IBD）分析證實自交系8112、沈5003、掖478和鄭58之間的關系，重現了鄭58形成過程中的重組事件。WU等[12]利用高通量芯片構建了黃改系的精細重組圖譜，發現了15個遺傳傳遞保守基因組區域。PAN等[9]利用骨干自交系形成的12個分離群體，解析了染色體上重組頻率的分布和變化規律，并鑒定到 143個重組熱點區域。ZHANG等[11]利用高密度芯片重現了黃早四和14份黃改系的重組事件，確定了每個黃改系的重組事件次數，并通過IBD分析對鄭58未知親本進行推測，結果發現，未知親本含有自交系丹340的同源染色體片段，使鄭58形成過程的重組信息進一步細化。LI等[13]利用黃早四親代及后代衍生系全基因組測序數據重現了黃早四及黃改系的形成歷史，發現 862個IBD保守區域，并且超過60%的IBD保守區域中存在選擇信號，在這些選擇區域中富集了大量的產量性狀相關 QTL。【本研究切入點】隨著近年來優良玉米雜交種的審定與推廣，大量優異的自交系得以培育，但對于京2416這一優新自交系并未進行系統地遺傳解析。【擬解決的關鍵問題】本研究通過分析京2416形成過程中的重組事件和黃早四基因組片段傳遞規律，解析京2416和X群[14-15]（由X1132x等雜交種構建的基礎材料選育出的優新種質）代表系高配合力的遺傳基礎，以期為黃改系的遺傳改良提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用4份優異黃改群自交系（黃早四及其衍生系京2416、京24和5237）為試驗材料。其中，京2416為京24和5237同群優系聚合選系。另外選用5份X群代表性自交系京724、京464、DH382、京725和京MC01作為測驗種，對4份黃改系進行雜種優勢分析。系譜來源見表1。

表1 9份自交系及其系譜來源Table 1 Name and pedigree source of 9 inbred lines

1.2 雜交組合的配制及田間鑒定

采用NCII遺傳設計將上述4份黃改系和5份X系組配20個雜交組合，于2016年在黃淮海、東北和華北挑選5個有代表性的種植區（北京市、河北省、河南省、吉林省和遼寧省）進行種植，隨機區組設計，2次重復。成熟后每行選取長勢一致的5株植株用于單穗粒重測定。

1.3 基因組DNA的提取

將9份試驗材料種子室溫萌發15 d左右，各取10株幼苗的幼嫩葉片混合磨樣，參照 ROGERS等[16]CTAB法提取玉米基因組DNA。檢測DNA純度濃度，以達到重測序標準。

1.4 雜種優勢和配合力分析

利用產量相關性狀單穗粒重的中親優勢和超高親優勢值評估4份黃改系的雜種優勢。中親優勢和超高親優勢的計算方法[17]如下：

中親優勢（mid-parent heterosis，%）=（F1-MP）/MP×100

超高親優勢（over-high parent heterosis，%）=（F1-HP）/HP×100

其中，F1、MP和HP分別代表F1各性狀平均值、2個親本各性狀平均值和高值親本各性狀平均值。

一般配合力（general combining ability，GCA）和特殊配合力（special combining ability，SCA）的相對效應計算方法[18]如下：

一般配合力：

代表P1中第i個親本的一般配合力相對效應值，代表P中第j個親本的一般配合力相對效應值，2代表親本i和親本j組合的特殊配合力相對效應值。n1代表P1中親本個數，n2代表P2中親本個數，xij代表親本i和親本j組合的平均值，x代表總平均值。

1.5 全基因組重測序

利用雙末端2×150 bp測序方法對供試材料進行基因組重測序。將原始數據進行檢測過濾，去除被污染和低質量序列，對過濾后得到的clean reads進行后續分析。使用 BWA（version: 0.6.1-r104）軟件[19-20]的默認參數將clean reads比對到B73 RefGen_v3參考基因組上[21-22]。為了減少SNP和InDel錯誤的數量，進一步過濾不匹配reads和非唯一reads，并通過GATK（version 20171018）中的IndelRealigener程序進行矯正。SNP和InDel的calling使用GATK和Picard V1.119軟件[23]進行計算。每個樣本 SNP和 InDel的 calling使用GATK中的HaplotypeCaller程序包獨立計算。使用GATK中的GenotypeGVCFs程序包進行多個樣本的vcf文件合并。對所有樣品進行進一步過濾，變異calling使用的最小 phred值置信閾值為 60，mapping質量高于 40，mapping質量的秩和檢驗閾值設置為-12.5，ReadPosRankSum 參數設置為-8，每個堿基的測序深度大于2。

1.6 主成分分析及系統發生樹構建

基于獲得的高質量 SNP和 InDel，使用 GCTA V1.26.0軟件[24]進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。使用Treebest v1.9.2軟件[25]計算遺傳距離矩陣，并在遺傳距離基礎上利用鄰接法（neighbor-joining method）構建系統發生樹。引導值（bootstrap values）經過1 000次計算獲得。

1.7 IBD片段分析

使用IBDseq[26]軟件對黃改系進行IBD片段識別，檢測IBD片段的LOD值設為3，IBD片段端部邊緣的LOD值設為2.5，滑動窗口內用于檢測的標記數量設為4 000，最大等位基因錯誤率設為0.0001。當京2416和兩選系親本之間都具有IBD片段時，以重組次數最少為原則，并且認定具有較高P值的IBD片段作為最終結果。

2 結果

2.1 京2416與X群種質的雜種優勢分析

利用京2416、京24、5237和黃早四4份黃改系材料與 X群代表系京 724、京 464、DH382、京 725和京MC01的雜交組合F1一年五點的單穗粒重表型數據，計算中親優勢和超高親優勢（表2）。結果表明，黃改系和X系之間的雜種優勢普遍存在，但不同雜交組合表現出的雜種優勢程度存在一定差異。20個雜交組合的單穗粒重中親優勢，為58.03%—113.93%，平均為85.72%，具有較高的中親優勢。其中京2416和5個X群代表系的中親優勢較為突出，均值為94.00%，明顯高于其2個選系親本和X系的雜交組合。20個雜交組合的單穗粒重超高親優勢為27.65%—84.57%，平均為64.02%，其中，京2416和5個X群代表系的超高親優勢均較高，均值為76.13%，整體水平高于其他3個黃改系和X系的雜交組合。

表2 4個黃改系和5個X系之間的雜交組合單穗粒重的雜種優勢Table 2 Heterosis of F1 kernel weight per ear of combinations between 4 HILs and 5 X lines (%)

進一步分析4個黃改系材料的配合力效應值，表3為4個黃改系親本單穗粒重的一般配合力相對效應值（relative effect of general combining ability，RGCA）和 20個雜交組合特殊配合力相對效應值（relative effect of specific combining ability，RSCA）。結果發現，4份黃改系的 RGCA為-6.75%—7.50%，20個雜交組合的RSCA為-6.54%—9.29%。黃改系中京2416的RGCA為7.50%，高于其2個選系親本京24和5237（2.68%和-3.68%），也高于黃早四（-6.75%）。說明京2416通過2個選系親本的基因組重組，較其選系親本和黃早四具有更高的配合力和雜種優勢潛力。

2.2 全基因組變異檢測及遺傳結構分析

為了從基因組層面解析京2416形成的遺傳機制，利用雙末端2×150 bp測序的方法對9份玉米自交系進行了全基因組重測序（表4），其中4份黃改系數據來源于已發表文獻[13]，5份X群材料為新測數據。平均深度約為 18.32倍基因組，共產生約 348.52 Gb的高質量測序數據。平均基因組覆蓋度和比對率分別為90.14%和92.32%，共鑒定到31.6 M的SNP和InDel變異信息。

利用鑒定到的高質量SNP和InDel對9份玉米自交系進行主成分分析和系統發生樹構建。通過主成分分析材料之間的親緣關系（圖1），黃改系和X系之間的遺傳關系較遠，在4份黃改系中京2416和京24的遺傳關系較近，5237與京24的遺傳關系較遠。通過系統發生樹分析9份材料的遺傳關系，結果和主成分分析結果保持一致。

表3 4個黃改系親本單穗粒重一般配合力相對效應值和20個雜交組合特殊配合力相對效應值Table 3 RGCA of 4 HILs parents’ kernel weight per ear and RSCA of 20 combinations

表4 9份玉米自交系的測序信息Table 4 Resequencing of 9 maize inbred lines

2.3 京2416形成過程中的重組事件

高通量測序為解析骨干親本形成的遺傳基礎提供了豐富的數據信息。高密度SNP和InDel分子標記的發掘和已知的系譜關系可以高分辨率地解析骨干自交系京2416形成的遺傳基礎。京2416的選育過程：首先將京24與5237雜交，再與京24回交1次，構建基礎選系群體，按照高大嚴育種技術（高密度：大于90 000株/hm2；大群體：S1代群體精量點播出苗9 000株以上；嚴選擇：嚴格選擇標準，堅決淘汰生產中可能導致嚴重減產隱患的不良性狀），經8代自交選育，創制出骨干自交系京2416（圖2-A）。利用高密度分子標記分析發現，京2416和5237、京24之間的遺傳相似度分別為0.765和0.906；5237和京24之間的遺傳相似度為0.745，說明兩者差異較大；黃早四和京2416、京24、5237三者之間的遺傳相似度分別為 0.763、0.748和 0.796。IBD分析結果表明，京24和5237兩者共發生了32次重組事件最終形成了京2416（圖2-B）。其中第1、3、4、5和7染色體的重組次數較多，分別為6次、3次、6次、4次和10次重組；第6、9和10染色體重組次數較少，均為1次重組；第2和8染色體沒有重組。重組的數量和頻率與前人的研究結果類似[10]。京 24和 5237在京 2416基因組中保留的比例分別為 80.96%和 19.04%，兩者對于京2416的遺傳貢獻差異較大。

圖1 9份自交系的主成分分析（A）和系統發生樹（B）Fig. 1 PCA analysis (A)and phylogenetic tree (B) of 9 inbred lines

圖2 京2416及其2個選系親本的遺傳背景Fig. 2 The genetic background of Jing2416 and the two parents

2.4 黃早四到京2416基因組片段傳遞

京 2416保留了黃早四傳遞下來的很多優勢性狀，例如抗病抗逆性強、適宜區域廣、早熟脫水快、自身產量及配合力高等，這些優勢性狀通過黃早四的IBD基因組片段進行傳遞。為了確定黃早四傳遞到京2416的IBD基因組片段，利用IBD方法對黃早四、京2416及其2個選系親本京24和5237的全基因組重測序數據進行分析。結果表明，在京24和5237中均存在一定數量的、連續的、大片段的IBD區段，并且重組位點基本沒有重合，暗示著兩者的育種選擇具有特異性（圖3）。黃早四基因組傳遞給京24和5237的比例分別為0.3849和0.5464，最終傳遞給京2416的比例為0.4236。比較黃早四傳遞給京24和5237的基因組片段，位置分布各具特點，根據LI等[13]黃改系馴化改良研究結果可知，黃改系中重要的 IBD傳遞區域和選擇消除區域在 2個京2416選系親本中被各自保留，而京2416從其親本黃改系中聚合了所有9個重要的IBD保守區域和選擇消除區域，例如5237的第4染色體和第5染色體區域，京24的第6染色體區域。說明京2416經過京24和5237的染色體重組，聚合獲得了更多的黃改系重要基因組區域（圖3）。

圖3 京2416形成過程中重要基因組區段的傳遞Fig. 3 The important genomic segments transferred in the process of Jing2416 formation

3 討論

京2416是通過京24和5237 2個選系親本自交系的遺傳重組形成的。京24為北京市農林科學院玉米研究中心選育的黃改群骨干自交系，具有較強的抗倒伏能力和良好的早熟性。但一般配合力不高，產量潛力有限，感絲黑穗病和青枯病等主要病害。所組配的雜交種主要適宜京津冀早熟區域，在其他區域表現不突出。為了對京24進行有針對性的改良，通過大量鑒定篩選出符合目標需求的優良自交系5237，5237有一定比例的旅系血緣，具有旅系的優良性狀及較好的抗病性和抗逆性。以（京24×5237）×京24構建基礎選系群體，通過“高大嚴”自交系選育方法[27-28]，創制出骨干自交系京 2416，具有配合力高、株型緊湊、抗倒伏、抗斑病、耐密等多個優良性狀，且適應性廣，綜合抗性好。該系目前已成為國家玉米良種攻關、七大農作物育種、國家玉米產業技術體系等多個重點項目及育種平臺研究應用的骨干自交系，為今后中國玉米種質的進一步改良和利用提供了良好材料基礎。

本研究以產量相關性狀單穗粒重為例，對京2416等4份黃改系與5份X群種質進行雜種優勢分析。其中京2416的中親優勢（94.00%）明顯高于其他2個選系親本，但略低于黃早四（94.9%），這可能是由于黃早四作為黃改系的原始系，本身的單穗粒重值較小，但其具有高配合力特性，這也是其能夠衍生形成中國最重要雜種優勢群的主要原因之一。玉米骨干自交系黃早四于20世紀70年代由北京市農林科學院和中國農業科學院作物科學研究所共同選育，具有適應性強、配合力高、株型緊湊、灌漿速度快等多方面優良性狀[3-5]。黃早四衍生形成的黃改系保持了黃早四的優良性狀和高配合力，LI等[13]對黃改系的研究結果表明，黃早四傳遞給其他黃改系的IBD片段中存在一些重要的基因組區域，這些區域在幾乎所有的黃改系基因組區域中均得到了保留，進一步研究發現，超過60%的選擇消除信號聚集在IBD保守區域。在育種過程中，人工選擇會使基因組產生大量的選擇區域，而這些選擇區域通常會富集稀有等位基因和優異農藝性狀基因[29-30]，對于黃改系的研究也證實黃改系的特征性選擇區域中富集了與產量相關的基因/QTL[13]。本研究發現，京2416的IBD傳遞區域中包含了大量的黃改系IBD保守區域和選擇消除區域，并且這些IBD區域分別來自不同的選系親本，同時京2416從其選系親本中聚合了黃改系幾乎所有的重要特征性選擇區域，證明高大嚴及同群優系聚合育種技術的有效性。基于上述選擇區域，將進一步挖掘功能位點，開發分子標記進行輔助選擇育種，以期在黃改系的遺傳改良中發揮更大作用。

4 結論

與其他3份材料（黃改系京24、5237和黃早四）相比，骨干自交系京2416具有更高的超高親優勢和一般配合力。京2416在選育過程中，由2個選系親本（京24和5237）中聚合了所有的9個重要黃改系特征性選擇區域，從分子水平解釋了京2416與X群代表系組配表現出更高配合力的遺傳基礎。