ICOS+/PD-1+濾泡輔助性T細胞比值在特發性膜性腎病疾病進展的臨床意義

莊金寶，郭志鵬，孫婧婷，石 旭，曹 揚*

(吉林大學第一醫院二部 1.檢驗科；2.呼吸科，吉林 長春130032)

膜性腎病(MN)是由免疫介導性炎癥所致的腎損害，以腎小球損傷為主，是導致腎病綜合征的一個常見病因，發病率僅次于IgA腎病及系膜增生性腎小球腎炎[1,2]。根據有無繼發性原因，MN可分為繼發性和原發性膜性腎病(IMN)。繼發性MN患者存在明確的誘發因素，如病毒感染、用藥及腫瘤等原因引起，而IMN的發病機制目前被認為是抗磷脂酶A2受體抗體識別并結合腎小球足細胞基底膜側的固有抗原，二者形成免疫復合物后沉積在腎小球毛細血管上皮處，導致毛細血管基底膜彌漫性增厚，損傷足細胞，破壞腎小球濾過屏障，產生蛋白尿[3,4]。

免疫復合物的形成是由B細胞分泌的抗體介導的自身免疫反應，因此IMN的發生也被認為與B細胞功能異常有關。濾泡輔助性T細胞(Tfh)是一類CD4+CXCR5+的T細胞亞群，表面標記物有ICOS(CD278)、PD-1(CD279)、BCL-6、IL-21等，可在CXCL13的趨化下被募集到淋巴濾泡，通過與B細胞接觸和(或)分泌細胞因子IL-21來促使B細胞分化為抗原特異性的漿細胞或者記憶B細胞，并協助激活B細胞，促進免疫球蛋白類別轉換，維持長時間的體液免疫應答，是輔助B細胞功能的主要T細胞亞群[5,6]。已有研究證明，在如IgG4 相關性疾病等B細胞功能異常疾病中均發現Tfh的異常[7,8]，但是不同Tfh亞群在不同分期IMN患者中的比例及其改變尚未完全明確。本文將在根據IMN患者24 h蛋白尿進行分組，研究Tfh及其不同亞群在不同組別患者中的比例及它們與患者臨床指標的相關性，為評估IMN疾病進展提供新指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院腎病科2019年1月-2020年2月間確診的IMN患者39例，男性24例，女性15例；健康對照組(HC)18例，男性11例，女性7例。根據臨床上對IMN患者的危險分級以及相應的治療標準，以患者24 h尿蛋白定量為分組依據，將IMN患者分為A組(<4 g)、B組(4-8 g)和C組(>8 g)3組。志愿者均已排除患有糖尿病、腫瘤、病毒性肝炎或其他感染，以及近6個月內服用過內類固醇或細胞毒性藥物，并排除過敏性紫癜腎炎、狼瘡性腎炎、和原發性腎小球腎炎患者。IMN患者組以及健康對照組的具體臨床指標見表1。

表1 IMN患者組及對照組臨床指標參數

1.2 樣本采集與分析

分別抽取患者及對照組志愿者清晨空腹靜脈血5 ml，應用拜耳ADVIA 1650全自動生化分析系統檢測甘油三酯、膽固醇、尿蛋白定量和血尿酸，并在顯微鏡下觀察鏡下血尿。

1.3 方法

1.3.1外周血單個核細胞(PBMC)的分離 取新鮮采集的肝素鈉抗凝的外周血，1 200 rpm/min離心去除血漿，將等體積淋巴細胞分離液置于15 ml離心管中，隨后吸取全血，沿離心管壁緩慢加至分離液上層，1 800 rpm離心30 min，用移液器將中間的白膜層(即單核細胞和淋巴細胞富集層)轉移至另一個新的離心管中，經PBS洗滌2遍后用RPMI1640培養基調整細胞數為1.0×106/mL備用。

1.3.2外周血中Tfh細胞表型的流式鑒定 取分離的PBMC 100 μl加入流式管中，每個流式管中同時加入以下熒光標記抗體：anti-CD4-APC、anti-CXCR5-PerCP、anti-CD278-PE，anti- CD279-FITC，同型對照管加入相應的同型抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，經PBS洗滌2遍后棄上清，1%多聚甲醛固定，24 h內用FACS Calibur流式細胞儀檢測，通過Flowjo軟件分析CD4+CXCR5+Tfh及其兩個亞群CD4+CXCR5+ICOS+Tfh、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh在外周血中所占比例。

1.3.3IL-21+Tfh細胞比例的測定 將分離后的PBMC用RMI1640培養基調整細胞濃度至5×105/well，鋪于24孔板，加入50 ng/mL PMA和1.0 μg/mL伊諾霉素，置于37℃孵箱，刺激2 h后加入BFA，繼續培養4 h，隨后收集細胞，加入PerCP-anti-CXCR5和APC-anti-CD4熒光抗體室溫孵育30 min，再加入固定破膜劑和Alexaflour 647-anti-IL-21熒光一抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后應用流式細胞儀檢測CD4+CXCR5+IL-21+Tfh細胞的比例。

1.3.4ELISA方法測定血清中IL-21含量 根據IL-21 ELISA檢測試劑盒說明書，設置標準品孔、待測樣品孔和空白對照孔。在標準品孔中加入經倍比稀釋的不同濃度標準品100 μl，在待測樣本孔中加入經樣本稀釋液(樣本稀釋5倍)稀釋好的待測樣本100 μl，置37℃孵箱溫育30 min，用洗滌液將孔板充分洗滌后加入酶標一抗工作液100 μl，37℃溫育30 min，充分洗滌后每孔加入底物工作液100 μl，37℃避光顯色15 min后將100 μl終止液加至每孔，15 min內用酶標儀在450 nm波長處測各孔吸光度(OD)值。以標準品濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線，隨后根據樣本的OD值計算出其對應的濃度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 IMN患者外周血循環Tfh細胞的比例分布特點

Tfh細胞表面標志分子為CD4和CXCR5，除此外Tfh常見的表面標志分子還有ICOS和PD-1。因此我們在不同分期IMN患者外周血中進行了總Tfh細胞(CD4+CXCR5+)及其兩個亞群：ICOS+Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+)和PD-1+Tfh(CD4+CXCR5+PD-1+)細胞的比例分布研究。在分離患者外周血單個核細胞后，與帶不同熒光染料的anti-CD4、anti-CXCR5、anti-CD278(ICOS)和anti-CD279(PD-1)一抗共同孵育，隨后利用流式細胞儀分析，各Tfh亞群的劃分如圖1所示。分析后結果表明，與HC對照組相比，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh細胞比例在B組患者中明顯升高，但是在C組患者中這三者的比例均明顯下降，如圖2所示。

圖1 流式細胞儀分析各Tfh細胞亞群圈門示意圖

*P<0.05

2.2 ICOS+/PD-1+Tfh比值在不同IMN分組中的變化

盡管外周血中Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh的比例在A組、B組患者中呈上升趨勢，在C組中明顯下降，但是我們發現，C組患者中ICOS+/PD-1+Tfh的比值卻明顯高于B組，而B組中該比值又高于A組(P<0.05)，如圖3所示。提示，ICOS+/PD-1+Tfh比值可能與IMN疾病進展相關。

*P< 0.05

2.3 Tfh細胞內外IL-21的表達水平

由于IL-21是Tfh細胞分泌的效應因子，可參與調節B細胞分化與增殖[9,10]，因此我們對Tfh胞內及胞外IL-21的表達進行了檢測。如圖4所示，通過ELISA技術檢測胞外IL-21水平，我們發現IMN患者組的血清IL-21表達均高于HC組(P< 0.05)，但其在3個患者組之間的表達沒有明顯差異。IL-21+Tfh細胞在IMN患者組中的比例均高于HC組，其中C組中的比例又明顯高于A組和B組，但在A、B兩組之間沒有明顯差異，如圖5所示。

*P<0.05

*P<0.05

2.4 Tfh亞群比例與IMN臨床指標的相關性

由于ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh在外周血中的比例在IMN患者中普遍升高，尤其在高危險患者組中，二者均明顯上調，因此我們推測ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh比例可能與IMN疾病進展相關。通過Spearman檢驗分析二者與IMN患者24 h尿蛋白量之間的關系，我們發現IMN患者24 h尿蛋白量與ICOS+/PD-1+Tfh比值之間呈正相關(r=0.8325,P<0.05)，而與IL-21+Tfh比例相關性不顯著(r=0.3825,P>0.05)，如圖6所示。

圖6 IMN患者24 h尿蛋白與ICOS+/PD-1+ Tfh比值的相關性

3 討論

IMN大多數發展相對緩慢，并且存在自發緩解與加重兩種趨勢，患者腎功能在輕中度時能維持正常，一旦進行性發展將導致腎功能不全。因此，評估患者進展至慢性腎功能不全的風險，對IMN患者進行危險分級再進行治療是針對IMN的重要治療理念。作為一種由抗原抗體免疫復合物沉積引起的足細胞損傷性疾病，分泌抗體的B細胞異常激活是IMN發病及進展的重要病因，而輔助型的Tfh細胞則在促進生發中心形成以及輔助B細胞活化、增殖的過程中發揮重要作用。Kraaijeveld等[11]發現應用鈣調磷酸酶抑制劑(他克莫司)抑制Tfh細胞后，B細胞分化也受到明顯抑制。Zhang等[12]發現在新發MN患者中，漿細胞升高的同時也伴隨Tfh細胞比例的上升。因此，我們需要進一步明確Tfh細胞在IMN疾病進展中的改變及其臨床意義。

Tfh是CD4+CXCR5+的T細胞亞群，其表面其他的標志性分子如ICOS、PD-1等對Tfh的遷移、定位、分化、發育起著重要作用，Tfh表面標志分子表達異常可以提示其功能的改變[5,6]。ICOS是CD28家族成員，屬于誘導性協同刺激分子，能夠和B細胞上的CD278配體結合傳遞刺激信號，對于促進Tfh表達IL-21并協助記憶性B細胞的形成有重要作用，其被T細胞活化所誘導，因此也是T細胞激活的一個標志[13]。IL-21由Tfh細胞產生，能夠誘導Tfh遷移、分化及表達ICOS，是Tfh存活及B細胞增殖分化過程中的關鍵因子[8-10]。PD-1也是CD28家族一員，但屬于免疫抑制性受體，其與配體PD-L1結合后傳遞抑制性信號，可抑制T淋巴細胞增殖及產生細胞因子，減弱ICOS和IL-21對Tfh細胞的活化[14,15]。另外，PD-1一方面抑制B細胞的增殖、分化和Ig類型轉換，但另一方面也能協助B細胞促進生發中心的形成[16]，因此PD-1在Tfh中的表達具有多方面功能，我們猜測這可能與PD-1表達的水平和時間點有關。

因此，本研究根據臨床上對IMN患者危險等級的劃分及治療方案的區別，以24 h蛋白尿為分組標準，在不同疾病進展階段的IMN患者中比較了Tfh細胞及ICOS+Tfh和PD-1+Tfh亞群在外周血中所占的比例及變化趨勢。我們發現，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh在低度(A組)和中度危險(B組)患者中的比例呈上升趨勢，并均高于健康對照組HC，然而在高度(C組)危險患者中這三者的比例卻均下降，我們推斷這可能與高度危險患者本身機體免疫功能明顯下降有關。分泌至胞外的IL-21在IMN患者血清中含量均高于HC組，但患者組間并沒有明顯差異。IL-21+Tfh細胞比例在C組中的表達水平明顯高于A組、B組和HC組，因此盡管高度危險患者體內Tfh及其亞群比例下降，但其中表達IL-21的Tfh比例卻升高了，提示高度危險患者體內Tfh具有更好的促進B細胞增殖和活化的能力。另外，我們還發現ICOS+Tfh和PD-1+Tfh兩者的比值隨IMN的危險分級明顯上升，這提示我們ICOS+/PD-1+Tfh比值可能與IMN疾病進展相關。隨后我們對ICOS+/PD-1+Tfh比值與IMN患者24 h尿蛋白量做了相關性分析，證明其與IMN疾病進展相關。因此，定期在IMN患者中檢測ICOS+/PD-1+Tfh比值有可能作為預測或評估IMN疾病進展的一個新指標。