維持性血液透析患者血清低氧誘導通路相關指標水平與腎性貧血的相關性

王金鑫,王楊威,張藝獻,郭思如,苗里寧,孫 晶

(吉林大學第二醫院 腎病內科，吉林 長春130022)

慢性腎臟疾病是多因素較復雜的疾病，最終多數以腎臟替代治療為主，其中維持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者人數呈逐年上升趨勢，而腎性貧血是其較常見的并發癥，其發病率不斷升高。研究發現腎性貧血機制復雜，除促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)缺乏外，鐵代謝、炎癥及低氧誘導通路的調節等因素也發揮了重要作用[1]。鐵調素(Hepcidin)又名肝臟抗菌多肽，是由肝臟細胞合成并分泌入血的一種小分子肽類激素，是鐵穩態的重要調節因子。低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIFs)是功能亞基α和結構亞基β組成的異源二聚體，其中HIF-α(HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α)決定了其生物學活性[2]。HIF-1α與HIF-2α共同促進氧傳遞和細胞對缺氧的適應[3]。HIFs介導的低氧誘導通路是調節鐵代謝、改善貧血的重要途徑，而脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase domain,PHD)是該通路的關鍵酶。PHD屬于Fe2+、2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶超家族成員，主要包括4種亞型(PHD1、PHD2、PHD3、PHD4)，其中PHD2是調節HIFs穩定性的重要亞型[4]。故本研究旨在通過檢測血清中Hepcidin、HIF-1α、HIF-2α、PHD在MHD患者中表達水平，比較各個指標在MHD患者血清中的表達差異及與腎性貧血相關指標的關系，通過定量數據分析探討低氧誘導通路在介導腎性貧血中的影響機制，對改善腎性貧血提供臨床指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年1月-2020年1月于吉林大學第二醫院血液凈化中心行長期規律MHD患者為研究對象。入組標準：①符合終末期腎臟病的診斷以及MHD的指征，MHD 3次/周≥12個月，使用動靜脈內瘺患者；②年齡≥18歲；③定期復查相應實驗室指標，臨床資料完善；④無鐵、葉酸等造血原料缺乏。排除標準：①存在各種病因導致的溶血、造血障礙等血液系統疾病者；②合并其他出血性疾病者；③合并肝炎、腫瘤等惡病質者；④合并嚴重感染者；⑤難治性心衰及嚴重心腦血管疾病患者；⑥應用除EPO之外的其他升血藥物者；⑦近1年內曾輸血患者。由以上標準，共計入組120例患者。根據血紅蛋白(hemoglobin,Hb)水平及有無應用EPO，分為EPO應答組：應用4個月以上正規EPO治療且Hb≥110 g/L；EPO低應答組：應用4個月以上EPO(≥150 IU·kg-1·周-1)治療且Hb<110 g/L[4]；無貧血組：近4個月內未使用過EPO治療且Hb≥110 g/L；貧血未治療組：近4個月內未使用過EPO治療且Hb<110 g/L。本研究經吉林大學第二醫院醫學倫理學委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料 收集入組患者基本信息：姓名、性別、年齡、原發病、體質指數(Body Mass Index,BMI)、透前收縮壓、透后收縮壓、EPO用量等。

1.2.2實驗室檢查 記錄患者入組時血液學檢驗信息：Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積、血小板計數、白細胞計數、血漿白蛋白、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、血清鐵濃度、血清鐵蛋白、轉鐵蛋白飽和度等。

1.2.3樣本的檢測 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，測定入組患者的血清中Hepcidin(R&D Systems，美國)、PHD( GenWay，美國)、HIF-1α和HIF-2α (MyBioSource,美國)表達水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料

共納入120例MHD患者，其原發疾病如下：慢性腎炎綜合征55例(45.83%)，糖尿病腎病25例(20.83%)，高血壓腎損害21例(17.5%)，腎病綜合征9例(7.5%)，多囊腎病6例(5%)，其他4例(3.33%)，各組原發病比較無統計學意義。EPO應答組患者的BMI比EPO低應答組高，但年齡及EPO用量較EPO低應答組低，差異有統計學意義(P<0.05)；EPO低應答組患者的年齡及透前收縮壓比無貧血組高，差異有統計學意義(P<0.05)。其一般情況比較見表1。

表1 各組MHD患者一般情況比較(n=120)

2.2 實驗室檢查

入組的MHD患者中，EPO應答組患者的血肌酐、血尿酸、Hb的表達水平比EPO低應答組高，但血清鐵蛋白與之相反，差異有統計學意義(P<0.05)；EPO應答組患者的血清HIF-1α、Hepcidin與PHD的表達水平比無貧血組高，但HIF-2α、Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積與之相反，差異有統計學意義(P<0.05)；EPO低應答組患者的血清HIF-1α、Hepcidin、PHD、血清鐵蛋白的表達水平比無貧血組高，但血清HIF-2α、血漿白蛋白、血肌酐、Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積比無貧血組低，差異有統計學意義(P<0.05)；EPO低應答組患者的血清HIF-1α、PHD及血清鐵蛋白的表達水平比貧血未治療組高，但血清HIF-2α的表達水平比貧血未治療組低，差異有統計學意義(P<0.05)；無貧血組患者的Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積的表達水平比貧血未治療組高，但血清Hepcidin比貧血未治療組低，差異有統計學意義(P<0.05)。其臨床指標比較見表2。

表2 各組MHD患者臨床指標比較(n=120)

2.3 血清Hepcidin與相關因素分析

MHD患者血清Hepcidin水平與血清HIF-1α、血清鐵蛋白、透前收縮壓、年齡成正相關(圖1：A-D)，與Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積、BMI成負相關(圖1：E-H)，均P<0.05。見圖1。

注:Hepcidin：鐵調素；MHD：維持性血液透析；HIF-1α：低氧誘導因子1α；Hb：血紅蛋白；BMI：體質指數

2.4 血清PHD與相關因素分析

MHD患者血清PHD的表達水平與血清HIF-1α、BMI、EPO用量、鐵劑用量成正相關(圖2：A-D)，均P<0.05。見圖2。

注:PHD：脯氨酰羥化酶；MHD：維持性血液透析；HIF-1α：低氧誘導因子1α；BMI：體質指數；EPO：促紅細胞生成素。

2.5 血清HIF-1α與相關因素分析

MHD患者血清HIF-1α的表達水平與血清Hepcidin、血清鐵蛋白、血清PHD成正相關(圖3：A-C)，與血清HIF-2α、血肌酐、血尿酸成負相關(圖3：D-F)，均P<0.05。見圖3。

注:HIF-1α：低氧誘導因子1α；MHD：維持性血液透析；Hepcidin：鐵調素；PHD：脯氨酰羥化酶；HIF-2α：低氧誘導因子2α。

2.6 血清HIF-2α與相關因素分析

MHD患者血清HIF-2α的表達水平與血清HIF-1α、EPO用量、鐵劑用量成負相關(圖4：A-C)，與紅細胞壓積成正相關(圖4：D)，均P<0.05。見圖4。

注:HIF-2α：低氧誘導因子2α；MHD：維持性血液透析；HIF-1α：低氧誘導因子1α；EPO：促紅細胞生成素。

2.7 Hb與相關因素分析

MHD患者Hb水平與血清Hepcidin、血清鐵蛋白、透前收縮壓、EPO用量、年齡成負相關(圖5：A-F)，與BMI成正相關(圖5：F)，均P<0.05。見圖5。

注:Hb：血紅蛋白；MHD：維持性血液透析；Hepcidin：鐵調素；EPO：促紅細胞生成素；BMI：體質指數。

3 討論

Hepcidin可經腎小球濾過，部分在近端腎小管中重吸收，最終以尿液形式排出體外。研究發現，將小鼠Hepcidin基因敲除后，小鼠體內Hepcidin表達水平下降，鐵負荷升高。相反,Hepcidin基因過度表達，可使小鼠體內鐵負荷降低[5]。本研究中發現MHD患者中無貧血組均較其余三組Hepcidin表達水平顯著降低，無貧血患者組的Hb、紅細胞計數與紅細胞壓積均較其余三組顯著升高，相關性分析后得出Hepcidin與Hb、紅細胞計數、紅細胞壓積成負相關，表明Hepcidin表達水平越高，MHD患者貧血越嚴重。MHD患者中Hepcidin表達明顯增高，其一與腎功能減退，Hepcidin排泄減少有關[6]，其二與MHD治療使患者處于微炎癥狀態有關，高濃度的Hepcidin限制了紅細胞對鐵的利用，從而在炎癥性貧血和EPO抵抗中起到重要作用[7,8]。

本研究中，MHD患者Hepcidin水平與炎癥指標血清鐵蛋白成正相關，與李萍[9]等研究結果一致。本研究還顯示EPO低應答組的血清鐵蛋白和Hepcidin水平較無貧血組顯著增高，與相關研究結果相符[10]，提示Hepcidin可能反映患者的微炎癥狀態。且EPO低應答組的血清鐵蛋白水平較EPO應答組顯著升高，Hb水平與血清鐵蛋白成負相關，共同反映了慢性炎癥狀態可能是導致EPO低應答機制發生的部分原因。慢性貧血導致儲存鐵減少，加之未進行鐵劑補充，因此貧血未治療組的血清鐵蛋白較其他3組低[11]。營養狀況在MHD患者的疾病進展中起重要作用，本研究中發現EPO應答組患者的BMI較EPO低應答組高，與文獻[12]等研究結果一致，EPO低應答組患者的血白蛋白較無貧血組低，MHD患者BMI與Hepcidin水平成負相關，與Hb水平成正相關，且年齡與Hepcidin成正相關，與Hb成負相關，共同提示營養不良與高齡患者更易受到炎癥狀態的影響，導致貧血與EPO低應答的發生。因此研發以Hepcidin為靶基因的藥物是治療鐵代謝異常的腎性貧血及其預后的新途徑，糾正營養不良與改善微炎癥狀態是改善腎性貧血的重要措施。Hepcidin或可成為EPO低反應的檢測指標。

缺氧是MHD患者常見的病理生理改變之一，低氧誘導通路是機體應對低氧環境的重要調節機制。有研究表明，在常氧環境下HIFs被PHD羥基化進而被蛋白酶降解，使HIFs的總體表達水平降低。正常人在低氧環境下，氧敏感的PHD活性受抑制，HIF未被羥基化，使得其穩定表達，并激活一系列低氧相關的靶基因[13,14]。該通路不僅能誘導內源性EPO的表達，還可降低患者Hepcidin水平以增加體內鐵利用，從而改善缺氧狀態，以糾正貧血[15]。本研究中，無貧血組患者的PHD較余三組患者低，HIF-2α則相反，反映了PHD在低氧環境下活性下降、表達減少，HIF-2α因未被降解而穩定表達，是改善腎性貧血的主要因子[14]。多篇文獻報道，HIF-2α是EPO合成及鐵代謝的主要調節因子[16,17]，EPO與鐵劑用量的多少又可反應患者內源性缺失的嚴重程度，本研究發現EPO和鐵劑用量與HIF-2α呈負相關，與PHD呈正相關，提示PHD的失活使HIF-2α穩定表達，進一步反映了PHD與HIF-2α在調節腎性貧血中的重要作用。

有研究表明，過度缺氧導致的HIF-1α活化會引起腎小管間質炎癥[18]，本研究中無貧血組患者HIF-1α的表達水平較余組低，且HIF-1α與Hepcidin、血清鐵蛋白呈正相關，提示HIF-1α亦可能反映患者的微炎癥狀態。HIF-1α高表達可介導腎臟纖維化，加重腎臟損害[19]，本研究中血清HIF-1α與血肌酐、血尿酸呈負相關，印證了上述研究結果。有研究發現[20]，從HIF-1α為主要激活靶基因到HIF-2α為主要激活靶基因的轉換，控制著從急性缺氧到慢性缺氧的過程，本研究中無貧血MHD患者的HIF-1α較余組患者低，HIF-2α、PHD則相反，且HIF-1α與HIF-2α、PHD成負相關，印證了在慢性腎臟病缺氧中HIF-1α作用微弱，HIF-2α起主要調節作用。因此外源性激活低氧誘導通路，是治療慢性腎性貧血的新方法。已經進入中國市場的PHD抑制劑，即通過調節低氧誘導通路改善貧血[21]。但當前的PHD抑制劑未進行PHD亞型的選擇，因此存在引起腫瘤惡化等副作用的可能[22]。從本研究結果來看，無貧血組中HIF-2α的高表達，提示HIF-2α是改善慢性貧血的重要因子，進一步研究出激活HIF-2α靶基因的相關藥物，或可對治療腎性貧血及減少副作用帶來新的治療方案。

綜上所述，MHD患者中貧血患者的血清Hepcidin、HIF-1α、HIF-2α與PHD表達水平與相關因素分析結果，反映了低氧誘導通路與MHD患者腎性貧血的發生密切相關，炎癥狀態、營養狀況、年齡等可影響腎性貧血的發生發展，亦可能是EPO低反應的部分原因。激活低氧誘導通路、糾正營養不良、改善炎癥狀態是糾正腎性貧血及改善預后的重要措施。PHD抑制劑在微炎癥狀態下亦可改善貧血，是EPO低應答患者改善貧血的新希望。但本研究為橫斷面研究，存在樣本量小，單中心、檢測指標少等不足，仍需更多高質量的分子水平及臨床研究進一步探討相應作用機制。