基層獸醫實驗室開展PCR 檢測的假陽性防范策略

吳玉疆，楊丁

（宜賓市動物疫病預防控制中心四川宜賓 644000）

目前，宜賓市市縣兩級共11 個獸醫實驗室均配置了熒光PCR儀，開展病毒核酸檢測。檢測過程中，出現過假陽性結果的情況，對檢測造成了困擾。市動物疫控中心獸醫實驗室通過在工作中分析總結，對假陽性的防范有了一定心得，適用于基層施行，現交流如下。

1 基層獸醫實驗室開展PCR 檢測出現假陽性的主要原因

1.1 意識不足，措施不夠

基層獸醫人員大多對PCR 檢測技術了解較少，防范意識不足，也不知防范重點，加之日常工作事務繁雜，在檢測工作中很容易忽略防范措施。

1.2 分區不當，硬件不足

宜賓市縣級基層獸醫實驗室一般按照BLS-1 設置和分區，尚有幾個未通過實驗室考核，規范化水平不夠。大多沒有或僅有一間病原檢測室，分區不夠清晰，也沒有氣流壓力系統，有的生物安全柜年久失修或沒有配備，容易導致污染發生。

1.3 經驗缺乏，操作不當

基層實驗人員的PCR 檢測操作經驗少，不夠熟悉，在處理、轉移、加樣等過程中均可能造成污染。加之目前檢測試劑敏感性都較高，試劑、吸頭、移液器、儀器等被污染，或是操作不當產生氣溶膠等，均可導致假陽性結果。

2 基層獸醫實驗室開展PCR 檢測的假陽性防范策略

檢測結果的時效性不言而喻，基層獸醫實驗室若發生污染后再分析原因消除污染這一過程費時費力，因此，防范于未然顯得特別重要。

2.1 合理分區，配置到位

PCR 檢測需按照樣品處理、試劑配制、加樣、上機反應四個過程，在四個獨立空間進行，且按此進行單向流向。結合宜賓市基層獸醫實驗室實際，樣品處理（包括核酸提取）主要在生物安全柜內進行，暫時沒有的可在通風櫥或超凈工作臺中進行。加樣在血清室中進行。試劑配制在相對獨立區域或另外一個超凈工作臺進行，如果條件受限可以和加樣安排在血清室的兩個不同處且試劑配制區處于上風口。熒光PCR 儀放在病原室、儀器室或其他相對獨立區域。

各區域根據空間大小安裝1 組以上紫外燈（平均功率為1.5W/m3），建議配備一臺移動紫外車。各區域物品專用，配備實驗服、一次性手套、口罩、帽子、記號筆、帶蓋垃圾桶、清潔工具等。樣品處理、試劑配制和加樣區各按需配備一組移液器，如加樣區最好0～10μL 和0～20μL 兩個量程各一把，有移液器的區域都配備帶蓋廢液缸。試劑要有專門冰箱存放，不能放入樣品。

2.2 提高意識，規范操作

2.2.1 檢測前準備進入前：有的基層獸醫實驗室離辦公區很近，人員進出較為隨意，應嚴格控制人員進出。進入實驗室必須換鞋（或鞋套），穿工作服。有時檢測人員會參與采樣，當日應盡量不進入實驗室，必須參與檢測時，應洗手、清洗鞋底、清潔衣服，整潔后方可進入，必要時更換鞋子，戴工作帽。同時，在檢測區域外用消毒劑噴灑樣品外包裝，對采血管、離心管等樣品保存管外表面進行消毒后方可帶入檢測區域。

進入后：打開生物安全柜風機保持10min 以上再使用。柜內不放無關物品，可在臺面上鋪一層吸水性墊料，以防污染和產生氣溶膠。檢查廢液缸中是否加入適量10%次氯酸消毒液，各垃圾桶內是否套上厚實垃圾袋。檢查試劑、耗材、用具等是否到位，避免檢測時來回“串室”取拿物品。檢查臺面是否潔凈，空調開啟后注意風速風向。

平時將EP 管、移液器吸頭、吸頭盒等封口放入柜內，避免開口敞放。新試劑可在干凈區分裝保存。

2.2.2 檢測中操作換：佩戴合適的手套，寬松的手套容易沾染。檢測過程中懷疑手套被污染時立即換掉。進出不同區域更換對應區域實驗服（標記或用不同顏色實驗服以便識別）、手套等。移液器和吸頭、EP 管等耗材只在該區域使用。

慢：生物安全柜內操作時動作應輕緩，在臺面中后部進行。移液器吸取時要輕緩，避免過快吸入內部污染或產生氣溶膠，最好使用帶濾芯的吸頭。移液器從采血管等較深容器中吸取樣品時，應傾斜容器，盡量不讓前端接觸容器內壁，若沾污應及時用酒精棉擦拭。從袋中取EP 管過程中，手不要觸及管蓋內側，可用鑷子夾取。樣品管、試劑管擰蓋時手與管蓋接觸面要少，管蓋擰開后，倒放在桌面上。檢測未完成前，其他實驗人員不要大動作收拾、打掃等。蓋：槍頭盒用完立即關蓋，避免吸完樣品或陽性對照的槍頭經過打開的槍頭盒、還未蓋口的PCR 管或試劑管蓋。

離：試劑和樣品在加樣前必須離心到管底，特別是陽性對照，以免吸液時沾到移液器前端污染。

分：加樣順序按陰性對照-樣品-陽性對照進行，分為潔凈區、操作區和廢棄區。左邊為潔凈區，放置吸頭、EP 管、試劑、管蓋等，中間為操作區，放置樣品、加樣板等，右邊為廢棄區，放置廢液缸等。這樣，加樣時從左到右移動，避免來回污染。加樣過程中的廢吸頭、廢棄物等要放入廢液缸內，且要保證能浸泡于消毒液中。

2.2.3 檢測后處理整備：整理臺面，用75%酒精和10%次氯酸擦拭消毒生物安全柜臺面，風機運行至少10min 再關閉，并開啟柜內紫外燈照射30min 以上，若是通風櫥或超凈工作臺則用移動紫外燈照射60min 以上。臺面、移液器等的表面同樣可用酒精和消毒劑擦拭。樣品、廢棄物等高壓滅菌處理，剪刀等消毒洗凈后高壓滅菌備用。PCR 反應管嚴禁開口也無需高壓，及時清理出實驗室。垃圾桶每日清倒更換新的垃圾袋，廢液缸更換消毒液。打開各區的紫外燈照射1h 以上。值得注意的是，高壓的主要作用是滅活病原而非清除核酸污染。

通風：樣品處理間的開窗通風在檢測后方可進行。除樣品處理區外，其他檢測區域如無核酸污染不用經常打開門窗通風，一般3～5d 換氣1h。

日常維護中，實驗地面、儀器表面、實驗服等根據工作頻率和檢測結果消毒和清潔。墻面、地面用浸泡有效氯濃度0.5%消毒液的抹布或拖布擦拭，注意污染區和清潔區的抹布、拖布等不要混用。儀器表面和金屬部件可用75%酒精消毒，非金屬物件可用含2%～3%有效氯的次氯酸鹽消毒，清水洗凈或擦拭。

2.2.4 污染處理基層獸醫實驗室PCR 檢測污染的原因主要是氣溶膠、移液器、吸頭、試劑等。一般污染可通過復檢或小范圍消毒、更換移液器、槍頭、試劑等后重檢排除。若上述處理無法消除，伴有假陽性不規律增多，應懷疑發生氣溶膠污染，需暫停檢測重點進行通風和清潔消毒處理，具體如下。

所有臺面、地面、用具、儀器外表面等用10%次氯酸清潔，儀器內表面和非玻璃外表面、管架等用0.5%次氯酸清潔，清洗實驗服，開窗大范圍通風數天并每日紫外燈照射，更換槍頭、試劑等。可選用核酸祛除劑，對重點區域進行噴灑。之后可通過環境監測（將配好的反應液開蓋暴露于各監測點半小時后直接上機反應）驗證污染是否消除。

3 保證基層獸醫實驗室PCR 檢測準確性的幾個要點

3.1 合理分區

合理分區是開展PCR 檢測的前提。基層實驗人員防污染意識不足，加之在不合理的分區內進行樣品處理、試劑配制、加樣等操作，污染風險較高。

3.2 重視細節

基層實驗人員往往日常工作事務繁雜，檢測過程中臨時離開、接打電話等時有發生，而PCR 檢測對注意力和操作要求較高，任何一個細節沒到位，都可能造成結果不準確。如在開放環境進行樣品前處理；天熱時空調大風速來回吹；廢液缸和垃圾桶不帶蓋或長期處于開蓋狀態；加樣時讓EP 管、槍頭盒長期打開并處于下風向，或棄槍頭時直接從打開的EP 管、吸頭盒上面劃過等。

3.3 隊伍穩定

分子生物學檢測逐漸成為基層獸醫實驗室的一項能力建設內容，相比傳統血清學檢測，PCR 等分子生物學檢測對實驗人員的技能提出了更高要求。在硬件保證、制度實施的前提下，檢測人員通過技能培訓、較長時間的崗位規范操作和定期的比對驗證等，不斷提升熟練度和經驗，才能保證每次檢測的質量。■