快速檢測梅花鹿黏膜病病毒的免疫膠體金試紙條研究

崔鶴馨，田來明，李男，田鑫，付曉霞

（長春市農業科學院長春 130111）

鹿黏膜病（DMD）是由黏膜病病毒（MDV）引起的幼鹿嚴重腹瀉、母鹿繁殖性障礙的疾病，不利于幼鹿的良性發育，降低成鹿的生育能力，嚴重時會導致鹿大量病死。既往有研究證實[1]，MDV 是導致牛發病的主要病原之一，也能造成羊、鹿等很多反芻動物染病。當下國內很多地區的鹿群養殖階段有程度不一的MDV 感染情況，一經感染，病原長時間無法清除，以致養鹿行業承受較重損失，不利于行業可持續的發展進程，故而應予以DMD 一定重視，加大快速檢測診斷方法的研究力度。

1 材料和方法

1.1 材料

1）試劑與耗材：膠體金試紙條材料套裝、氯金酸；

2）儀器：攪拌器、電子天平、干燥箱、高壓鍋以及電鏡等；

3）主要試劑類型：10%HAuCl4溶液、10%NaCl 溶液以及碳酸鉀0.2mol/L 等。把以上試劑整合至容積為10mL 的離心管內，充分攪拌后用蒸餾水定容到10mL，低溫（-20℃）條件下保存以備用。再把以上制備的試劑加進500mL 燒杯中，加熱攪拌至完全溶解，自然冷卻后，將其pH 調節到8.3，定容到500mL。

1.2 方法

首先，制備20nm 膠體金溶液。提取兩個整體硅化的200mL 三角燒瓶，依次兌入50mL 四蒸水溶液，安置在攪拌器上加熱處理到沸騰。而后依次加入100μL 的10%的氯金酸、2.5mL 檸檬酸鈉溶液，使溶液最后顏色穩定在酒紅色。針對制備好的膠體金溶液予以冷卻處理后，用0.21μm 予以過濾處理，借助透射電鏡觀測膠體金顆粒狀態。

其次，依照常規方法組裝膠體試紙條。即在滴加品滴加后，溶液會自行朝向吸水板方向流動，于金標墊位置，BVD/MDV 會和膠體金探針相整合，溶液持續朝向前方流動，與BVD/MDV 相結合的金標抗體于檢測線位置會結合一種抗BVD/MDV 的單抗（1B11），此時檢測線上就會形成膠體金溶液匯聚情況，進而呈現出相應顏色。

再者，確定試紙條的檢測線和質控線的最適宜濃度。本次試驗結果表明，IgG、1F11 株單抗對應的濃度依次是1 和1.5mg/mL，且被包裹在試紙條內時，測線和質控線形態優良，色澤適中。

最后，采用免疫膠體金試紙條檢測DMD。在遼寧省某鹿場養殖現場收集30 份鹿糞等設為樣本，編號為1～30，各樣品均取用適量鹿糞，兌入適量PBS 溶液以使其呈懸浮狀態，量取180μL 溶液滴加到試紙條附帶的樣品墊上進行檢測。針對樣品內剩余溶液，取用適量，trizol 法捕獲RNA 并合成cDNA，用BVD/MDV 特異性引物PCR 擴增。膠體金檢測與PCR 擴增實驗階段均設置1 份陽性與陰性對照。

2 結果

2.1 膠體金溶液制備

溶液呈酒紅色，清澈透亮。透射電鏡檢查階段測得金顆粒大小約為20nm，均勻分布。

2.2 免疫膠體金試紙條檢測DMD

PCR 擴增結果提示，陽性檢出樣品8 份（26.7%），陰性為22 份（73.3%）。膠體金試紙條檢測結果和PCR 檢測結果統一。

3 討論

現階段，國家相關部門已頒發了DMD/MDV 的防控計劃，并在畜群層面上取得一定成效，很多防控措施是多維性的，單純依靠疫苗接種等單一方面通常無法取而預期成效。為有效防控DMD/MDV，制定周全策略，最先做的工作便是了解病毒有關臨床表現及對畜牧業形成的影響。若想要從一個畜群內徹底清除DMD/MDV 的目標范疇，需突破的難點是防控病毒侵入為感染DMD/MDV 的牲畜，為達成以上目標，通常會采用多樣化的診斷檢測、疫苗免疫及生物安全計劃等措施。故而應從了解畜群DMD/MDV 感染狀況、現行管理辦法及后續階段可能新引進的措施等方面做出判斷。

膠體金顆粒內徑大小影響抗體標記及后期試紙條檢測環節的精確度、敏感性。既往有報道指出，伴隨膠體金顆粒內徑的擴增過程，膠體金探針在溶液內的安穩性有跌落趨勢；但內徑過小，也不利于維持金顆粒的均勻性、分散度，也會降低試紙條的穩定性。故而，在制取膠體試紙條階段，推薦把顆粒調控為20nm，通常能取得較優良的檢測結果。

本次試驗研究階段，選用檸檬酸三鈉還原法制取了20nm 膠體金溶液，電鏡檢查提示顆粒呈圓形，直徑基本上均是20nm 左右，均勻分布，提示成功制取了膠體金溶液。選擇疑似MDV 感染的30 份臨床樣品加以檢測，結果提示試紙條與PCR 陽性檢出率一致，均為26.7%。并且經檢測后發現，本試驗研究階段制備的試紙條特異性優良。最低能檢測出103TCID50/mL 的病毒濃度，在MDV 感染檢測領域中有一定推廣價值。█