柴胡皂苷a抑制PTZ誘導小鼠海馬星形膠質細胞增殖和多藥轉運蛋白的表達*

單 萍，張繼龍，笱玉蘭，羅利俊

(武漢市第一醫院， 武漢 430022)

癲癇是一種常見的神經系統疾病，主要病理表現為神經過度興奮、神經元異常放電。在我國，癲癇患者人數高達900萬，占全球總患病人數的18%，且每年50余萬人被確診為癲癇[1-3]。臨床研究數據顯示，60%～70%的癲癇患者經過合理的抗癲癇藥物治療后病情可得到有效控制，甚至治療2～5年后可停藥觀察[1]。但仍有30%左右的癲癇患者由于對藥物不敏感等原因導致治療效果不佳，發展成為難治性癲癇或耐藥性癲癇，直接影響患者的死亡率和致殘率，嚴重干擾患者的生活質量，同時增加患者家庭及社會的經濟負擔[3]。多藥轉運體(multidrug transporters，MDTs)蛋白表達的異常可直接影響藥物到達作用靶點而導致耐藥，是影響癲癇患者治療效果最為直接的原因之一。有研究[4-5]顯示，在難治性癲癇患者體內存在P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)等MDTs高表達現象。此外，腺苷激酶(adenosine kinase，ADK)是星形膠質細胞中調節腺苷含量的關鍵因子之一，ADK活性的異常可引起突觸內腺苷含量失衡進而引發癲癇[6]。傳統觀點認為，癲癇的發作是神經元的異常興奮所致，但隨著癲癇發病機制的深入研究，發現星形膠質細胞功能紊亂和代謝失調參與神經元過度興奮和癲癇發作，其在癲癇發病中同樣發揮著重要作用[7-8]。柴胡皂苷a(saikosaponin a, SSa)是臨床常用中藥柴胡的主要藥理成分柴胡皂苷的單體，具有多種藥理功能，如抗癲癇、抗炎、抗驚厥等[9-10]。本研究繼續深入研究SSa的抗癲癇作用機制，采用戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)模擬刺激海馬星形膠質細胞，探究SSa對PTZ激活小鼠海馬星形膠質細胞的干預作用及對MTDs及ADK表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

5只SPF級1～3 d新生C57BL/6小鼠，購自三峽大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(鄂)2017-0012，飼養于華中農業大學SPF級動物房，取材當天處死。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F-12培養基購自Gibco公司(11320082)；戊四氮(PTZ)購自Sigma公司(P6500);柴胡皂苷a(SSa)購自國藥集團化學試劑有限公司(xw080063)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司(C1062)。兔多克隆anti-P-gp抗體(ab170904)、兔多克隆MRP2抗體(ab203397)、兔單克隆BCRP抗體(ab207732)和兔多克隆ADK抗體(ab38010)以及兔二抗(ab6702)購自Abcam公司；兔單克隆GAPDH抗體購自Cell signaling technology公司(2118)。熒光顯微鏡購自OLYMPUS公司(IX50);酶標儀購自Thermo公司(Multiskan FC，美國);熒光定量PCR儀與凝膠成像系統均購自Bio-Rad公司(CFX-Connect 96，美國);全自動化學發光分析儀購自上海天能科技有限公司(Tanon-5200，中國)。

1.3 小鼠海馬星形膠質細胞培養與藥物處理

參考Mccarihy法[11]并加以改進后分離培養小鼠海馬星形膠質細胞，經免疫熒光鑒定細胞后應用于本實驗。采用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養小鼠海馬星形膠質細胞，并按隨機數字表法分為對照組(A組)、10 mmol/L PTZ刺激組(B組)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa藥物組(C組)和10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa藥物組(D組)。采用無血清DMEM/F-12配制不同藥物，B組采用10 mmol/L PTZ處理2 h，C和D組在10 mmol/L PTZ處理之前分別加入0.625 mg/L或1.25 mg/L SSa處理6 h，A組不經過任何處理。分組處理后于熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態。

1.4 MTT檢測細胞增殖能力

選取生長狀態良好的小鼠海馬星形膠質細胞，制作單細胞懸液并計數。調整細胞濃度后按照1×104個細胞/孔的標準，接種小鼠海馬星形膠質細胞于96孔板內，每組設置3個復孔，置于37 ℃恒溫恒濕的培養箱中繼續培養48 h。然后采用無血清培養基進行細胞饑餓處理24 h，隨后各組細胞進行不同的藥物處理，并繼續置于培養箱中培養。待藥物處理時間結束后，每孔加入20 μL 5% MTT溶液，輕輕混勻后繼續置于培養箱中孵育4 h。4 h后取出，2000×g室溫離心5 min，小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩混勻后采用酶標儀測定540 nm波長處吸光度OD值。按照公式計算細胞增殖率：細胞增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.5 Realtime PCR檢測相關MTDs及其他相關基因

采用Trizol法提取各組細胞的總RNA，采用逆轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，存入-20 ℃保存備用。測定cDNA濃度后稀釋濃度至100 ng/μL，用于后續Realtime PCR反應。使用SYBR Green PCR試劑盒檢測P-gp、MRP2、BCRP和ADK的轉錄表達水平，以GAPDH作為內參。P-gp引物：F：5’- CTCATAGTTGCCTACATC-3’，R：5’- ATCTCCTGATTCATTATAGC-3’；MRP2引物：F：5’- ACTGTGCTCACGATTGC-3’，R: 5’- ACTCCCGAACTTCTCCT-3’；BCRP引物：F：5’- GCAGATTCTAAGGTCGGA -3’，R：5’- AGAGGATGGAAGGGTCAG -3’；ADK引物：F：5’- CTCTGAAACCAAATGACC -3’，R：5’- CCCAAACTTATCTATCCC -3’；GAPDH引物：F：5’- CCTTCCGTGTTCCTAC -3’，R：5’- GACAACCTGGTCCTCA -3’，所有引物均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

1.6 Western blot檢測相關蛋白

收集各組細胞沉淀，采用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，并經BCA定量法測定總蛋白溶液的濃度。依據測定的總蛋白濃度，選取20 μg總蛋白配制蛋白上樣體系，經SDS-PAGE進行蛋白分離并轉移至PVDF膜上。采用5%脫脂牛奶(PBST配制)室溫封閉處理1 h，PBST洗膜后加入相應的一抗(P-gp：1∶500；MRP2∶1∶1000；BCRP：1∶1000；ADK：1∶500；GAPDH：1∶1000)置于4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次后依次加入山羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h后，繼續使用PBST洗膜3次，采用ECL顯色液進行顯色，并采用全自動化學發光分析儀檢測信號并成像，采用TANON GIS軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 PTZ對小鼠海馬星形膠質細胞形態的影響

圖1示，于顯微鏡下觀察小鼠海馬星形膠質細胞形態，A組細胞胞質豐富、形態多樣，多呈不規則形態；B、C、D組均出現星形細胞，從胞體發出多個突起，細胞核呈圓形或橢圓形，其中D組細胞數量及細胞突起少于B和C組。

注：對照組(A組)、10 mmol/L PTZ刺激組(B組)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa藥物組(C組)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa藥物組(D組)圖1 海馬星形膠質細胞形態觀察比較(200×)

注：對照組(A組)、10 mmol/L PTZ刺激組(B組)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa藥物組(C組)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa藥物組(D組)：aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs 圖3 各組細胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK mRNA表達水平檢測比較

2.2 PTZ對小鼠海馬星形膠質細胞的活化作用及SSa的干預作用

圖2示，細胞增殖活性檢測結果與A組比較，B組細胞增殖率顯著升高(P<0.05)，表明PTZ能夠促進小鼠海馬星形膠質細胞增殖，誘導細胞活化。不同劑量的SSa藥物組(C和D組)細胞增殖率較PTZ刺激組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且高劑量的D組作用效果更加明顯。這些數據表明，SSa能夠抑制PTZ誘導小鼠海馬星形膠質細胞的異常活化，且具有劑量依賴性。

注：對照組(A組)、10 mmol/L PTZ刺激組(B組)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa藥物組(C組)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa藥物組(D組)；aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs C圖2 MTT檢測細胞增殖活性比較

2.3 SSa對PTZ激活小鼠海馬星形膠質細胞中MDTs和ADK mRNA表達的影響

圖3示，與A組比較，B組細胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK的mRNA均顯著性上調(P均<0.05)；與B組比較，C和D組細胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK mRNA表達水平顯著下調(P均<0.05)，且隨SSa劑量增加各指標的mRNA表達水平降低。結果表明，PTZ能夠誘導小鼠海馬星形膠質細胞中MDTs和ADK mRNA表達水平上調，SSa藥物處理可抑制PTZ的這一作用。

2.4 SSa對PTZ激活小鼠海馬星形膠質細胞中MDTs和ADK蛋白表達的影響

圖4示，進一步檢測各組細胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK蛋白表達水平，與A組比較發現，B組細胞中P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表達水平均急劇增加，與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)；與PTZ刺激組(B組)比較，兩個SSa藥物組(C和D組)細胞中P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表達水平均顯著下調(P均<0.05)。結果表明，SSa可抑制PTZ誘導的P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表達的上調。

注：對照組(A組)、10 mmol/L PTZ刺激組(B組)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa藥物組(C組)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa藥物組(D組)；aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs C圖4 各組細胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK蛋白表達水平檢測比較

3 討論

正常情況下，星形膠質細胞發揮著機體保護作用，可為神經元提供營養，同時也可有效清除興奮性神經遞質谷氨酸[2, 12]。然而長期慢性癲癇發作可誘導星形膠質細胞活化，引發海馬硬化，同時還可產生和釋放神經營養因子等促使癲癇發作[11-12]。本研究數據也證實了這一觀點，常用慢性癲癇誘導藥物PTZ刺激小鼠海馬星形膠質細胞后可誘導細胞增殖，促使細胞活化。

盡管對癲癇的治療已取得一定成效，但難治性癲癇因易產生耐藥性其治療效果不甚理想。針對難治性癲癇的耐藥機制，目前存在2種假說，其中一種假說認為藥物作用靶點發生改變，從而降低了對抗癲癇藥物的敏感性[13-14]；另一假說轉運蛋白假說認為，MTDs的表達或功能在大腦中得到增強，可阻礙抗癲癇藥物通過血腦屏障到達腦部病灶部位，從而抑制抗癲癇藥物對中樞神經系統的作用，影響藥物療效[13, 15]。MTDs是一類跨膜蛋白，能夠利用ATP水解產生的能量，逆濃度梯度運輸藥物或底物[16]。研究發現，多種MTDs(如P-gp、MRP1/2)等在難治性癲癇患者腦組織或免疫細胞中過度表達[17-19]。本課題組前期研究也發現，PTZ誘導慢性癲癇小鼠腦海馬組織中P-gp蛋白表達水平上調[20]。此外，半轉運蛋白乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP)同樣參與血腦屏障中藥物的轉運，且在血腦屏障上呈現高表達的狀態，阻止藥物等底物進入大腦，其在藥物通過血腦屏障過程中與P-gp發揮協同屏障的作用[21]。Wang等[22]研究發現，活化的星形膠質細胞中P-gp和MRP1表達上調，因此推測高表達MTDs的活化星形膠質細胞可能參與癲癇耐藥過程。本研究數據也顯示，PTZ組海馬星形膠質細胞中P-gp、MRP2以及BCRP表達水平均高于對照組，表明星形膠質細胞中P-gp、MRP2以及BCRP等MTD蛋白表達異常與癲癇的耐藥性具有緊密的相關性。

柴胡總皂苷是中草藥柴胡的主要成分，依據其化學結構的不同可分為多種單體，其中SSa和柴胡皂苷d(SSd)是柴胡皂苷的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗癲癇等多種作用。研究發現，SSa可顯著抑制PTZ點燃癲癇發作的時間及嚴重程度，延長癲癇發作的潛伏期[23]。在PTZ誘導的慢性癲癇大鼠和氯化鋰-匹羅卡誘導的難治性癲癇大鼠中，SSa均發揮了明顯的抗癲癇作用，促進星形膠質細胞對谷氨酸的清除，降低海馬中P-gp蛋白表達水平[24-25]。本研究數據發現，在海馬星形膠質細胞中，SSa能夠抑制細胞的活化與增殖，顯著抑制PTZ誘導的MTDs表達，提示SSa對海馬星形膠質細胞活化、增殖及耐藥的影響可能與其抗癲癇作用密切相關。腺苷是腦組織中廣泛存在的抑制性神經遞質，可有效降低神經興奮性。但癲癇發生時，星形膠質細胞中ADK可有效清除細胞內腺苷，造成胞外腺苷濃度降低。由此可見，ADK的表達上調可影響腺苷含量水平，進而引發癲癇[6]。在本次研究結果中，SSa對PTZ誘導海馬星形膠質細胞ADK表達增加具有明顯的抑制作用，進一步說明SSa通過對海馬星形膠質細胞產生影響，進而發揮癲癇治療作用。

綜上所述，本研究數據顯示，SSa可有效抑制PTZ誘導海馬星形膠質細胞的活化與增殖，同時降低細胞中多種MTDs以及ADK的表達。提示SSa可能通過逆轉多藥轉運蛋白的表達水平，降低難治性癲癇患者的耐藥性，增加患者的治療療效，這將為SSa應用于臨床治療難治性癲癇提供理論依據。