黃芪甲苷通過調(diào)控腎素原受體-自噬途徑改善嘌呤霉素誘導(dǎo)腎足細胞骨架損傷的作用研究*

曾又佳，賀良平，張 冰

(1. 深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033；2. 重慶九龍坡中醫(yī)院，重慶 400000；3. 廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518033)

大量蛋白尿的發(fā)生與腎小球臟層上皮細胞(又稱足細胞)結(jié)構(gòu)和功能紊亂密切相關(guān)。腎素原受體(prorenin receptor，簡稱 PRR)是近10年來發(fā)現(xiàn)的一種定位在局部組織(包括腎臟、心臟、肝臟等)并與腎素原/腎素結(jié)合的蛋白受體，最初的認識多集中在配體-受體結(jié)合在腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)激活中的作用[1]。與其他RAAS基因不同，PRR基因是一種組織特異性基因，不直接通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用，但它在各臟器組織細胞自穩(wěn)和存活中發(fā)揮重要作用[2]。PRR缺失導(dǎo)致腎臟足細胞內(nèi)囊泡酸化不足，從而顯著抑制胞內(nèi)蛋白的自噬性降解，破壞足細胞自穩(wěn)性[3]。盡管多種模型證實PRR在腎臟中的保護作用[4]，但在嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞損傷模型中，PRR與自噬的關(guān)系研究鮮見。

中藥黃芪是治療多種腎臟疾病的要藥，對治療大量蛋白尿療效良好。黃芪的多種組分中，黃芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)在多種腎損傷模型中具有保護作用[5]。諸多學者認為，黃芪在減輕腎臟炎癥、纖維化、抗氧化應(yīng)激、改善細胞代謝等方面有顯著益處[6]，但在足細胞保護機制方面研究鮮見。該研究主要探討AS-IV在治療嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞損傷中的作用及可能機制。

1 材料

1.1 細胞來源

人腎足細胞株AB 8 /13，英國Bristol大學Moin A．Saleem教授贈送。

1.2 試劑與儀器

嘌呤霉素氨基核苷(Puromycin，PAN，美國EMZO公司)，用滅菌注射水配成10 mg/ml的儲備液; AS-IV(中國食品藥品檢定研究院)，以二甲亞砜 (DMSO, D8418, 美國Sigma公司)溶解配置成80 mmol /L的貯存液，4 ℃避光保存，應(yīng)用時以培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO終濃度不超過0.1%；RPMI-1640 (61870036)、胎牛血清(10099141C)、胰蛋白酶(25200056)，購自美國Gibco公司；ITS添加物(胰島素+轉(zhuǎn)鐵蛋白+硒)，購自美國life technologies公司；synaptopodin抗體(ab224491)，PRR抗體(ab264763)，購自英國Abcam公司；α-tubulin(#2144)、SQSTM1/P62(#88588)，購自美國Cell Signaling Technology公司；LC3II一抗(NB100-2220)購自美國Novus公司，HRP標記的羊抗鼠/兔二抗，購自美國Cell Signaling Technology公司；Alexa Fluor594鬼筆環(huán)肽(A12381)、Alexa Fluor488羊抗鼠/兔 IgG(H +L)熒光二抗(A-11001,A-11008)，購自美國Life公司；BCA蛋白濃度檢測試劑、ECL發(fā)光劑，購自美國Pierce公司；SDS-PAGE電泳儀(P25)、凝膠成像儀(ChemiDoc MP, 美國Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(Eclipse Ti-u, 日本尼康)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

AB8/13細胞接種于含有10%胎牛血清、1% ITS添加物的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2條件下培養(yǎng)，33 ℃孵育箱中增殖，當細胞密度達到60%時，傳代后置于37 ℃培養(yǎng)箱中，接種至預(yù)先鋪了膠原Ⅰ的35 mm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)12～14 d，待足細胞分化成熟時開始試驗。

2.2 細胞處理

2.2.1 小RNA干擾 足細胞分化至12 d時，2組細胞分別用對照小RNA(GAPDH siRNA)和PRR小RNA(PRR siRNA序列：5’-CCUACAACCUUGCGUAUAA-3’，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)轉(zhuǎn)染、干擾腎足細胞。干擾48 h后，2組細胞孵育30 μg/ml 嘌呤霉素24 h，免疫細胞熒光法觀察2組細胞骨架蛋白的變化，免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白變化及骨架蛋白表達。

2.2.2 AS-IV干預(yù) 細胞分化至12 d時，根據(jù)文獻報道及預(yù)實驗MTT篩選的濃度范圍[6-7]，選擇不同濃度AS-IV(0，5，25，50 μg/ml)與嘌呤霉素共同干預(yù)AB13細胞48 h。免疫細胞熒光法觀察2組細胞骨架蛋白的變化，免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白變化及骨架蛋白表達。

2.2.3 免疫印跡法 處理后的細胞PBS輕輕漂洗后，每皿中加100 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(德國羅氏)的1×細胞裂解液(美國CST公司)，冰上裂解10 min后收集細胞，13000 r/min 4 ℃離心10 min，檢測上清液蛋白濃度，配平后加入等量2×上樣緩沖液(德國Sigma公司)，煮沸10 min。對不可溶P62蛋白，則在裂解后加入高濃度尿素以獲取不可溶P62蛋白包涵體。取12 μg蛋白上樣到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，再轉(zhuǎn)印到0.45 μm的NC膜上(美國Bio-Rad公司)，含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，孵育一抗，4 ℃搖床過夜，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光劑反應(yīng)1 min，置于凝膠成像儀發(fā)光顯影。

2.2.4 細胞免疫熒光 細胞轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱時接種到共聚焦皿 (美國MatTek公司) 中，細胞處理后用4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)固定10 min，0.1%TritonX -100/PBS透化5 min, 5%BSA/PBS封閉1 h，一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，Alexa Fluor488二抗室溫孵育1 h，加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑 (美國Life公司)，通風櫥通風晾干。而F-actin用Alexa Fluor594的鬼筆環(huán)肽(美國Life公司)直染，1% BSA /PBS封閉30 min，再加鬼筆環(huán)肽直染。

3 結(jié)果

3.1 腎素原受體在嘌呤霉素誘導(dǎo)足細胞損傷中的表達變化及作用

3.1.1 腎素原受體時間依賴性表達變化 圖1示，嘌呤霉素干預(yù)3 h后，足細胞即開始出現(xiàn)PRR表達上調(diào)，隨后持續(xù)增加，24 h表達呈最高峰(較0 h比較，P<0.05)，其后逐漸下降，48 h時顯著下降。

圖1 嘌呤霉素(30 μmg/ml)干預(yù)足細胞后腎素原受體蛋白時間依賴表達變化比較(0～48 h)

3.1.2 抑制腎素原受體則抑制足細胞自噬性降解，下調(diào)骨架蛋白表達 圖2示，通過PRR 小RNA干擾48 h后，檢測PRR蛋白表達及對照組(GAPDH siRNA組)自噬和骨架相關(guān)蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小RNA干擾PRR后，足細胞PRR表達明顯減少，下游LC3II蛋白表達下調(diào)，但自噬降解相關(guān)P62蛋白表達顯著增加，細胞特異性骨架蛋白synaptopodin表達也隨之減少。在嘌呤霉素干預(yù)24 h后，亦呈現(xiàn)類似的表達變化。PRR siRNA組較GAPDH siRNA組PRR表達增高不明顯，P62蛋白表達增強，2組synaptopodin表達均下調(diào)，與GAPDH siRNA組比較，PRR siRNA組synaptopodin表達下降更加明顯。

圖2 PRR小RNA干擾及嘌呤霉素干預(yù)后下游自噬相關(guān)蛋白及骨架蛋白表達變化比較

3.1.3 抑制腎素原受體加速嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞骨架變化 圖3示，GAPDH siRNA和PRR siRNA分別干擾48 h后加入嘌呤霉素(30 μg/ml)24 h。對照組(GAPDH siRNA)加入嘌呤霉素干預(yù)24 h后，足細胞骨架蛋白出現(xiàn)早期紊亂，F(xiàn)-actin由絲狀放射排列逐漸聚縮為鳥巢樣排列。相對于GAPDH siRNA組，PRR siRNA組足細胞F-actin形態(tài)排列更為紊亂，F(xiàn)-actin向細胞核回縮、變形更明顯。嘌呤霉素刺激24 h后，足細胞形態(tài)開始發(fā)生改變，正常狀態(tài)下synaptopodin 點線狀均勻分布，而 PAN 刺激24 h后，GAPDH siRNA組腎足細胞內(nèi)synaptopodin分布較混亂，部分呈點狀聚集。而PRR siRNA組腎足細胞內(nèi)synaptopodin表達下調(diào)，細胞胞質(zhì)向細胞核回縮，細胞形態(tài)不規(guī)則，2組細胞核比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 腎素原受體RNA干擾48 h嘌呤霉素孵育24 h后足細胞骨架提前損傷變構(gòu)比較(100×)

3.2 不同濃度AS-IV改善嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞骨架損傷作用

3.2.1 不同濃度(0，5，25, 50 μg/ml)的AS-IV均能改善嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎足細胞損傷 圖4示，嘌呤霉素(30 μg/ml)孵育足細胞48 h后，骨架蛋白F-actin出現(xiàn)明顯的鳥巢樣改變，細胞回縮明顯，synaptopodin點狀聚集，向細胞核回縮。而同時孵育低劑量(5 μg/ml)、中劑量(25 μg/ml)、大劑量(50 μg/ml)AS-IV48 h后，腎足細胞骨架與嘌呤霉素組比較，細胞骨架變構(gòu)、回縮不明顯，骨架損傷明顯改善。其中，低劑量、中劑量AS-IV對足細胞變構(gòu)改善最明顯，高劑量AS-IV組足細胞凋亡細胞增多。

圖4 不同濃度AS-IV改善嘌呤霉素(干預(yù)48 h)誘導(dǎo)的足細胞骨架損傷變構(gòu)比較(100×)

注：與空白對照組比較：*P<0.05圖5 不同濃度AS-IV通過提高腎素原受體表達調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達，改善嘌呤霉素誘導(dǎo)的足細胞骨架蛋白變化

3.2.2 AS-IV通過提高PRR-降低自噬降解發(fā)揮足細胞保護作用 圖5示，通過免疫印跡法檢測上述模型中PRR蛋白、自噬相關(guān)蛋白(LC3II、P62蛋白)和足細胞骨架蛋白synaptopodin的表達變化。結(jié)果提示，嘌呤霉素干預(yù)48 h后PRR表達下降，而低(5 μg/ml)、中(25 μg/ml)濃度的AS-IV可提高PRR蛋白表達。嘌呤霉素干預(yù)48 h后，自噬抑制相關(guān)蛋白P62表達明顯上調(diào)(P<0.05)、LC3II表達下調(diào)(P<0.05)，而AS-IV明顯下調(diào)，嘌呤霉素誘導(dǎo)的P62蛋白表達上調(diào),上調(diào)嘌呤霉素誘導(dǎo)的LC3II表達下調(diào)。嘌呤霉素誘導(dǎo)可輕度下調(diào)骨架蛋白synaptopodin表達，但差異不明顯。低(5 μg/ml)、中濃度(25 μg/ml)的AS-IV組較模型組可提高synaptopodin蛋白表達，但差異無統(tǒng)計學意義。該結(jié)果提示，AS-IV可能通過改善嘌呤霉素誘導(dǎo)的自噬水平下降，發(fā)揮足細胞穩(wěn)定作用。

4 討論

足細胞是分化終末期細胞，較腎臟其他固有細胞，其本身有較高的自噬水平[8]，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進細胞存活。因此，了解足細胞的自噬上下游的調(diào)節(jié)機制，有助于尋找恢復(fù)足細胞骨架穩(wěn)定的新方法。

前文提到，腎素原受體可通過干預(yù)自噬流的降解過程[2,4]，發(fā)揮足細胞保護作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自噬在多種細胞損傷時，在早期發(fā)揮重要的代償及保護作用。自噬形成時胞漿型的LC3會轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば停葱纬蒐C3II。LC3II蛋白的表達部分程度體現(xiàn)了自噬水平，如果自噬形成增多或自噬溶酶體降解減少，都可能出現(xiàn)LC3II蛋白表達上調(diào)。但LC3II水平并不能準確反映自噬流的降解情況，需結(jié)合其他相關(guān)蛋白表達變化進行判讀[9]。P62 是選擇性自噬過程中最重要的貨車蛋白, 也被稱為選擇性自噬受體, 它是連接 LC3B 與待降解泛素化底物的橋梁[10]。P62 結(jié)合泛素化蛋白進入到自噬體后，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而被清除。自噬流抑制時P62含量增加, 相反自噬流活化時P62水平下降。如果不可溶P62蛋白明顯增加，無論LC3是否發(fā)生I型向II型轉(zhuǎn)化，均代表自噬流阻斷[11]。 既往研究模型中已證實，腎素原受體在上游參與調(diào)控自噬流[6, 12-13]。

AS-IV在多種足細胞損傷模型中，可能通過提高足細胞自噬水平而最終發(fā)揮如抗細胞凋亡、抗炎、抗氧化等保護作用[14-15]。 在高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷模型中，李佑生[16]等研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可改善受損足細胞的黏附功能；徐蕾[17]等，研究發(fā)現(xiàn),AS-IV可通過抑制PKC/MAPK通路修復(fù)損傷的人足細胞裂孔膜。本實驗則從體外探索嘌呤霉素誘導(dǎo)足細胞損傷模型中自噬流的變化及可能的調(diào)控機制。

該實驗證明，腎素原受體在嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎足細胞變構(gòu)中，呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達變化。腎素原受體的下調(diào)可抑制腎足細胞自噬的降解，并加速嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎足細胞骨架損傷，提示腎素原受體通過干預(yù)自噬途徑，維持腎足細胞的骨架穩(wěn)定。不同濃度的AS-IV(5 μg/ml，25 μg/ml，50 μg/ml)均可不同程度地改善嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎足細胞骨架變構(gòu)，特別是低中劑量AS-IV對受損足細胞有顯著的改善作用。該作用部分是通過改善腎素原受體表達，從而改善下游的自噬降解而實現(xiàn)的。